水杨酸诱发的NO介导了丹参悬浮培养细胞中丹酚酸B的生物合成

水杨酸(SA)可诱导丹参悬浮培养细胞中一氧化氮(NO)产生、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活化及丹酚酸B(Sal B)的生物合成。为了阐明NO对丹参悬浮培养细胞中Sal B生物合成的影响及作用机理,本实验利用NO供体硝普钠(SNP)、NO合成酶抑制剂L-NNA(Nω-nitro-L-arginine)、NO淬灭剂c PITO(carboxy-2-phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide)以及PAL抑制剂L-AOPP(L-2-aminooxygen-3-phenyl acrylic acid)分别处理丹参悬浮培养细胞,并对其胞内NO水平、PAL活性和Sal B积累量进行了检测。结果表明,硝普钠(SNP)处理显著促进了NO产生、PAL活性和Sal B的积累,而L-NNA和c PITO抑制上述过程,说明NO诱发PAL活性提高并参与了SA诱导的Sal B生物合成;L-AOPP显著抑制了PAL活性及Sal B积累,却对NO产生没有显著影响,揭示NO位于PAL的上游。这说明SA诱发的NO产生、PAL活化及Sal B合成之间存在因果关系,即NO通过激活PAL触发Sal B生物合成。     

水杨酸诱发的丹参悬浮培养细胞内H2O2迸发与其培养基碱化的关系

水杨酸(salicylic acid,SA)处理可诱导丹参悬浮培养细胞内H2O2产生及其培养基碱化。利用NADPH氧化酶抑制剂咪唑(imidazole,IMD)、H2O2淬灭剂二甲基硫脲(dimethylthiourea,DMTU)、质膜H+-ATPase抑制剂钒酸钠(Na3VO4)及激活剂壳梭孢菌素(fusicoccin,FC)处理丹参悬浮培养细胞,探讨SA诱导的H2O2迸发与培养基碱化之间的关系。结果表明,H2O2可促发培养基碱化,IMD和DMTU抑制SA诱发的培养基碱化,说明H2O2参与SA诱发的培养基碱化过程;SA抑制质膜H+-ATPase活性,Na3VO4引发培养基碱化并使H2O2迸发时间提前,FC处理逆转了SA诱导的培养基碱化及H2O2迸发,说明质膜H+-ATPase调控培养基pH值变化,培养基碱化促进了H2O2产生。因此,丹参悬浮培养细胞内H2O2水平与其培养基碱化程度之间相互关联、共同作用,协同响应SA的诱导。     

Ca2+对丹参培养细胞中迷迭香酸合成及其相关酶活性的影响

探究了外界Ca2+(0~50 mmol/L)对丹参培养细胞迷迭香酸合成及其相关酶活性的影响,并利用细胞膜钙离子通道抑制剂异搏定(Verpamil,VP)及钙离子载体A23187初步探讨了外界Ca2+浓度变化影响丹参培养细胞次生代谢的机制。结果显示:培养6 d时的丹参细胞中迷迭香酸积累量与外界Ca2+浓度显著相关,其中10 mmol/L Ca2+最有利于迷迭香酸的合成,迷迭香酸最大积累量达20.149 mg/g DW,比1 mmol/L和3 mmol/LCa2+处理分别高37.3%和20.4%。分析迷迭香酸合成的两条支路上的关键酶PAL和TAT活性变化发现,两种酶活性亦受外界Ca2+浓度影响,且活性变化先于迷迭香酸的积累,说明这两种酶均参与迷迭香酸的生物合成,但PAL比TAT促进作用更明显。进一步用VP和A23187处理发现,外界Ca2+影响迷迭香酸的合成是通过影响胞内Ca2+浓度实现的,胞外Ca2+内流可能参与了这一过程。     

H2O2参与水杨酸诱导丹参培养细胞中丹酚酸B合成的信号转导

过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)为活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的一种,存在于许多生物体系中并介导植物中多种生理和生化过程。为了探讨H2O2作为信号分子在水杨酸(Salicylic acid,SA)诱导丹参培养细胞合成丹酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)过程中的作用,分别考察了SA和H2O2、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、二甲基硫脲(2-(4-carboxy-2-phenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide,DMTU)及咪唑(Imidazole,IMD)对苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)和酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)的活性及Sal B含量的影响。结果表明,SA处理可有效地诱导丹参培养细胞中H2O2产生、PAL和TAT活性升高以及Sal B合成积累量的增加;外源施加10～30 mmol/L H2O2也可以有效促进PAL、TAT活性升高和Sal B合成积累量的增加;用H2O2的清除剂CAT处理发现,CAT对SA或外源H2O2诱导的Sal B合成积累具有消除作用,说明H2O2可能作为SA诱导Sal B积累过程中的上游信号分子起作用;用H2O2淬灭剂DMTU处理,可以有效抑制SA对Sal B合成的促进作用;用质膜烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide vadenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶(H2O2来源的主要酶)抑制剂IMD处理,可以抑制Sal B的合成,但这种抑制效果可以部分被外源施加的SA削弱,说明通过HADPH氧化酶产生的H2O2受阻时,SA诱导的Sal B合成积累也会受到抑制。表明H2O2是介导SA诱导丹参培养细胞中Sal B合成积累的信号分子。     

培养条件对离体丹参根苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性的影响

以2年生丹参离体根为材料,研究了反应液pH、反应时间和材料预培养时间以及苯丙氨酸、肉桂酸和阿魏酸溶液处理对根中苯丙氨酸解氨酶(PAL)和多酚氧化酶(PPO)活性的影响.结果表明:(1)PPO和PAL的最适反应pH分别为6.0和8.8,反应时间分别为30 min和60 min,最适预培养时间为10~12 h.(2)苯丙氨酸处理能抑制PAL活性,且在0.062 5 mmol·L-1时抑制作用最大,但随浓度增加无规律性变化;浓度低于1.0 mmol·L-1的苯丙氨酸处理能提高PPO的活性,且在0.062 5 mmol·L-1时促进作用最强.(3)不同浓度肉桂酸均能抑制PAL活性,并在0.125 mmol·L-1时抑制作用最大,且低浓度(≤0.125 mmol·L-1)的影响比高浓度(≥0.25 mmol·L-1)更大;低浓度肉桂酸(≤0.25 mmol·L-1)处理能提高PPO的活性并在0.25 mmol·L-1时达最大值,而在0.25~2.0 mmol·L-1浓度范围内肉桂酸对PPO活性的抑制作用随浓度的升高而增强.(4)阿魏酸对PAL表现出产物反馈抑制作用,并在0.125 mmol·L-1时抑制作用最大,但对PPO的活性有促进作用,且在0.5 mmol·L-1时PPO活性最高.可见,离体丹参根的苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性测定有其适宜的pH、反应时间和与培养时间,苯丙氨酸、肉桂酸和阿魏酸溶液对2种酶活性的影响不同且浓度间有差异.     

荣莉酸甲酯对丹参培养细胞中迷迭香酸生物合成及相关酶活性的影响

茉莉酸甲酯是植物细胞响应外界刺激产生的重要信号分子,与植物次生代谢物的生物合成有关。本研究考察了茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）对丹参培养细胞中迷迭香酸（rosmarinic acid,RA）生物合成的影响。结果显示,诱导24h后可显著提高丹参愈伤细胞中RA的积累量及其相关酶（PAL、TAT）的活性,在48h时RA积累量和酶活性达到最大。布洛芬（IBu）处理可抑制MeJA对RA积累量和相关酶活性的促进作用,外源施加MeJA可部分解除IBU对RA合成及其相关酶活性的抑制作用。说明MeJA可以显著促进丹参培养细胞中RA的生物合成,IBU抑制了MeJA合成、PAL和TAT活性,从而导致了RA合成受阻。     

Ca2+在水杨酸诱发的丹参培养细胞培养基碱化过程中的作用

利用质膜钙离子通道抑制剂LaCl3、异搏定(Verapamil,VP),钙离子载体A23187,内膜系统钙离子通道抑制剂2-APB和LiCl处理,研究水杨酸(SA)诱发的丹参培养细胞内Ca2+迸发在培养基碱化过程中的作用。结果显示:SA处理诱发丹参培养细胞培养基碱化,质膜钙离子通道抑制剂LaCl3和VP、内膜系统钙离子通道抑制剂2-APB和LiCl单独处理均可显著抑制SA处理诱发的培养基碱化过程,但质膜钙离子通道抑制剂对SA处理诱发的培养基碱化的抑制作用要显著强于内膜系统钙离子通道抑制剂;当两类钙离子通道抑制剂同时使用,培养基碱化过程被完全抑制,甚至培养基出现酸化趋势;钙离子载体A23187可以显著促进培养基碱化过程。以上结果说明,由水杨酸诱发的胞外Ca2+内流与胞内钙库Ca2+释放均参与了丹参培养基碱化的诱导过程,但胞外Ca2+内流的作用更重要。本研究揭示了SA诱发的Ca2+与丹参细胞培养基碱化之间的关系,为更深层次地阐明植物次生代谢调控机制提供理论基础。     

杜仲黄酮指纹图谱研究

采用HPLC指纹图谱对杜仲黄酮和银杏黄酮进行了标示,并将杜仲黄酮、银杏黄酮和沙棘黄酮HPLC指纹图谱进行了比较,发现杜仲黄酮和银杏黄酮很相近;杜仲黄酮、银杏黄酮和沙棘黄酮三者均富含槲皮素。研究认为,杜仲黄酮具有广泛的应用前景和较大的开发价值。     

Ca2+对水杨酸诱发的丹参幼苗丹酚酸B生物合成的影响

为研究Ca2+在水杨酸诱导丹参幼苗丹酚酸B生物合成过程中的作用,分别用激光共聚焦显微镜和高效液相色谱仪检测胞外Ca2+通道抑制剂Vp和LaCl3,胞内Ca2+通道抑制剂LiCl以及胞内钙调素拮抗剂TFP处理前、后水杨酸诱导丹参叶片保卫细胞内Ca2+荧光强度和丹酚酸B含量的变化。结果表明,水杨酸 (SA) 处理后6 min即可诱发丹参幼苗叶片保卫细胞内Ca2+迸发,持续时间为2~3 min,丹参幼苗丹酚酸B生物合成量亦显著增加,且丹酚酸B合成量的增加发生在Ca2+迸发之后。胞外Ca2+通道抑制剂,胞内Ca2+通道抑制剂以及胞内钙调素拮抗剂均可抑制水杨酸诱导的Ca2+迸发和丹酚酸B的生物合成。结果表明水杨酸诱发的Ca2+对丹参幼苗丹酚酸B生物合成具有重要的调控作用。     

杜仲次生代谢物合成积累与物候期的研究

通过对南温带和北亚热带生长的杜仲不同月份次生代谢物含量与物候期关系的研究,发现杜仲次生代谢物合成积累的第一次高峰期出现在“芽开绽期”后的70d左右;第二次高峰期出现在“落叶盛期”。当掌握了杜仲次生代谢物合成积累高峰期(最佳采收期)的物候期时,无论南方、北方,也无论高山、平原地区,就可根据这一物候期,大致估算出该地区杜仲的最佳采收期。