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为了揭示肠道病毒71型(enterovirus71,EV71)的复制与宿主细胞Raf/MEK/ERK信号通路(简称ERK通路)的相互关系,本研究应用临床诊断为手足口病的患儿疱疹液,通过易感细胞分离培养、RT-PCR及序列测定,以及Western印迹技术等方法,成功分离到EV71临床株.进一步用该分离株感染易感细胞,通过观察宿主细胞p-ERK1/2蛋白磷酸化水平、病毒特异性衣壳蛋白VP1水平、病毒半数组织培养感染量(50%tissue culture infectious dose,TCID50),以及感染细胞的CPE等指标,以期揭示ERK通路在EV71复制的作用.结果表明,EV71的复制可引起细胞ERK通路的活化;而用MEK1/2特异性的抑制剂U0126预先抑制ERK通路的活化,可显著地降低受染细胞上清液中的病毒的感染滴度(以TCID50表示)、受染细胞中EV71VP1蛋白水平、受染细胞中EV71核酸水平,以及受染细胞的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE).提示ERK信号通路的活化对EV71的复制具有重要的作用.本研究为进一步阐明EV71在宿主细胞内的复制机制、寻找新型抗病毒靶标等研究奠定了良好的基础. 相似文献
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重组福安泰-03抑制人脐静脉血管内皮细胞的迁移和增殖 总被引:1,自引:0,他引:1
研究重组福安泰-03(recombinant Fuantai-03,rFAT-03)对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)迁移和增殖的影响.聚碳酸酯膜小室趋化运动模型(transwell model)检测rFAT-03对HUVECs迁移能力的影响;MTT法检测rFAT-03对HUVECs和多种人癌细胞生长的影响;荧光显微镜观察rFAT-03作用下HUVECs的形态变化;膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(annexin V-fluorescein isothiocyanate,annexinV-FITC)双染检测rFAT-03对HUVECs早期凋亡的影响;流式细胞术分析rFAT-03对HUVECs周期及凋亡的影响;Western印迹检查rFAT-03对HUVECs血管内皮细胞生长因子(VEGF)、Bax和Bcl-2表达的影响.结果显示,rFAT-03明显抑制HUVECs细胞的迁移和增殖,其抑制效果与剂量和作用时间相关.0.20mg/mL恩度(endostar),0.10、0.20mg/mLrFAT-03作用HUVECs24h,对细胞迁移的抑制率分别为32.0%、32.6%、57.1%(P0.01).0.20mg/mL恩度,0.05、0.10、0.20mg/mLrFAT-03作用HUVECs72h,其对细胞生长的抑制率分别为40.9%、63.7%、69.3%、87.0%.但rFAT-03对多种人癌细胞株的生长却无明显影响.rFAT-03处理HUVECs24h,细胞的早期凋亡率增加(P0.05).rFAT-03阻滞HUVECs于G0/G1期,并呈现典型的凋亡峰.终浓度为0.05、0.10、0.20mg/mLrFAT-03作用于HUVECs24h,G0/G1期细胞指数分别为63.4%、67.5%和75.7%(对照组为62.1%),凋亡指数分别为4.2%、8.5%和10.3%.rFAT-03下调HUVECs的VEGF和抑调亡基因Bcl-2的表达,上调促凋亡基因Bax的表达,其效果与剂量相关.结果提示,rFAT-03明显抑制HUVECs细胞的迁移和增殖,诱导其凋亡,它的这些作用与其下调VEGF、Bcl-2表达,上调Bax表达密切相关. 相似文献
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聚乙二醇伴随式离子交换层析分离重组乙肝病毒表面抗原 总被引:1,自引:1,他引:0
对由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的多聚亚基蛋白HBsAg在离子交换层析过程中容易因亚基解离而导致蛋白解聚和丧失生物活性的难题,实验中选择聚乙二醇(PEG)作为保护剂伴随式(Polyethylene Glycol-Accompanied)离子交换层析分离纯化HBsAg。实验表明,在流动相中加入1% PEG10000(W/V)作为纯化伴侣, HBsAg的回收率由55% 左右提高到80%以上,纯化倍数基本保持在12左右。对纯化产物进行SDS_PAGE分析表明,1% PEG10000的纯化伴侣伴随式离子交换层析能全部保留HBsAg的糖基化蛋白单体(27kD和30kD),高效液相色谱联用多角度激光散射(High Performance Size Exclusion Chromatography_Multiangle Laser Light Scattering, HPSEC-MALLS )进一步分析阐明了PEG能促使HBsAg颗粒尺寸分布更均一,结构更接近天然乙肝表面抗原。 相似文献
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白细胞介素24(interleukin 24,IL-24)是近年来新发现的1个IL-10家族细胞因子,具有明显的抗肿瘤活性.为了研究开发高活性、低分子量的IL-24,并探讨其用于肿瘤靶向治疗的可能性,本研究在前期基础上,进一步构建并制备了缺失N端103个氨基酸残基的IL-24(hIL-24Δ103)重组腺病毒,并观察了其对A549细胞生长增殖和凋亡的影响.首先,采用PCR技术扩增IL-24第104位至第206位氨基酸区域的编码序列,制备hIL-24Δ103重组腺病毒.用Ad-hIL-24Δ103重组腺病毒感染肺癌A549细胞. MTT分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染显著抑制了A549细胞的生长.Hoechst 33258染色和流式细胞仪分析结果表明,Ad-hIL 24Δ103感染导致细胞凋亡.Western 印迹分析结果表明,Ad-hIL-24Δ103感染导致了PKR和eIF-2α蛋白的表达上调与磷酸化激活,提示PKR和eIF-2α参与了hIL-24Δ103导致的细胞生长抑制和细胞凋亡过程的调节.关键词 人白介素24;腺病毒;细胞增殖;细胞凋亡 相似文献
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水泡性口炎病毒核蛋白基因的表达及初步应用 总被引:3,自引:0,他引:3
将水泡性口炎病毒编码群特异性抗原的N基因片段克隆至pMD18-T克隆载体质粒中,构建N基因克隆重组质粒,进行核苷酸序列分析。然后亚克隆插入pBAD/Thio TOPO表达载体,经PCR限制性内切酶分析、测序鉴定,筛选获得N基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆,成功构建了水泡性口炎病毒N基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达,可稳定、高效地表达N蛋白抗原。SDS-PAGE、Western blotting及间接ELISA试验结果表明,表达蛋白为融合蛋白,质量约63.5 kD,其表达产量约占菌体总蛋白的16%,相当于92mg/L。融合蛋白中含有水泡性口炎病毒群特异性的核蛋白抗原,应用表达的VSV核蛋白抗原建立了酶联免疫吸附试验,通过对186份山羊、豚鼠实验动物人工感染VSV的血清样品和参考血清样品的检测,并与微量血清中和试验进行了比较,结果表明:以表达的VSV核蛋白为包被抗原的酶联免疫吸附试验是一种特异性强、敏感性高、快速、简单、安全的检测方法,抗原制备成本低。 相似文献
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采用PCR技术扩增水稻根UV B敏感基因2.1(ROOT UV B SENSITIVE 2.1,RUS2.1)四个不同片段[OsRUS2.1(1 1317),OsRUS2.1(1 138),OsRUS2.1(139 879),OsRUS2.1(880 1317)],连接到T载体pMD18 T Simple上,测序无误后分别亚克隆到猎物表达载体pGADT7上。结果表明:四个OsRUS2.1基因片段的表达载体构建成功,读码框正确;分别转化这四个猎物表达载体于酵母感受态细胞Y187中,用LacZ、MEL1活性检测法和营养缺陷型培养基SD Leu DO培养法进行自激活检测和毒性检测,结果表明构建的四个OsRUS2.1不同片段的猎物表达载体对酵母菌株Y187均没有转录激活活性和毒害作用,可用于后续研究。 相似文献
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通过冷冻干燥、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析、Sephadex G 100凝胶过滤柱层析,SP葡聚糖凝胶C 25阳离子交换柱层析等分离纯化技术,对烟草吡哆胺 丙酮酸转氨酶进行分离纯化。采用苯肼衍生化方法检测活性,并对其基本酶学性质进行分析。结果显示:该酶被纯化了92.34倍;最适温度为70 ℃,最适pH为9.0。在pH7.0~9.0内稳定且热稳定性较好,80 ℃保温3 h仍有51.55%的酶活力;在最适反应条件下,测得反应底物吡哆胺和丙酮酸的Km值分别为6.337 mmol?L 1和0.867 mmol?L 1。该结果为进一步研究烟草体内VB6代谢机制奠定了基础。 相似文献