His-FemA融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的 构建His标签的金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药相关蛋白FemA的融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌中表达,为进一步研究femA基因的生物学功能和临床应用奠定基础.方法 根据GenBank中金黄色葡萄球菌femA基因序列,利用Primer Premier 5.0设计PCR引物,并在引物的5'加入BamHI及SalI酶切位点;以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模版,PCR扩增出femA基因片段.将目的DNA片段及质粒pQE30分别进行双酶切、连接并转化大肠埃希菌DH5α;阳性克隆以PCR、双酶切及测序进行鉴定.将鉴定正确的pQE30-femA重组质粒转化大肠埃希菌JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-femA融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot分析对表达蛋白进行验证.结果 经PCR、双酶切签定及序列测定,证实重组质粒pQE30-femA构建成功;重组质粒pQE30-femA转化大肠埃希菌JM109经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western blot分析显示表达出53 kD目的蛋白;经Bandscan软件分析,目的蛋白质在4h的表达量占细胞总蛋白的27.5％.结论 成功构建了His-FemA原核表达载体(pQE30-femA),并在大肠埃希菌中高效表达.     

检测miRNA活性的双荧光素酶单载体

本研究报道了微小RNA靶分子鉴定及其活性分析的内参内置型双荧光素酶单载体与其应用.利用非连接酶依赖的基因克隆技术,借助一步式二元搭桥耦联长距离PCR及大肠杆菌体内同源重组方法,将萤火虫荧光素酶基因(Firefly luc)融合到pRL-TK载体的海肾荧光素酶基因(Renilla luc)和氨苄青霉素抗性基因之间,构建为两种荧光素酶基因表达框并置的单载体报告系统,命名为pMiSensor. 在海肾荧光素酶基因的3′非翻译区引入多克隆位点Xba I和Apa I,便于克隆目的基因的3′UTR.海肾荧光素酶为报告基因,萤火虫荧光素酶为内参基因.多种哺乳动物细胞系的转染实验证实,pMiSensor可同时有效表达两种报告基因,其酶活显示出宽广的线性范围.通过构建pMiSensor-CCNE1报告载体,证明pMiSensor能够重现miR16对细胞周期蛋白CCNE1的调控作用.通过转染miR16抑制剂,证明pMiSensor-CCNE1可作为一种灵敏的生物感应器,探测细胞内微小RNA的活性变化.该双荧光素酶单载体具有重复性高、操作简便、定量准确的优点,适用于微小RNA靶分子的筛选、鉴定和确认, 也适用于在细胞水平定量分析微小RNA的活性变化.     

金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药辅助基因femB的克隆和原核表达

金黄色葡萄球菌femB基因与甲氧西林高水平耐药密切相关,可能成为开发抗MRSA药物的新靶位.以金葡菌基因组DNA为模板,PCR扩增femB全长基因,所得片段与pGM-T载体连接并转化感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆以PCR、双酶切及测序鉴定.将鉴定正确的目的片段定向克隆到pGEX-4T-1表达载体中,转化至大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达GST/FemB融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot对融合蛋白进行鉴定.结果显示,重组质粒在宿主菌中获得了高效表达,融合蛋白相对分子质量为75 kD,该融合蛋白可与抗GST-tag抗体特异结合;表明femB基因的原核表达系统构建成功,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.     

MMP14在非小细胞肺癌中的表达及其与预后的关系

肺癌5年生存率低,侵润和转移是导致其死亡的主要原因.探讨MMP14(matrix mettallo proteinase 14)在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)组织中的表达,及其与浸润转移和预后的关系.通过采用免疫组化检测92例NSCLC组织及25例癌旁正常组织中MMP14蛋白的表达,并分析其与临床病理学特征及预后的关系.免疫组化结果显示,MMP14蛋白在NSCLC组织中表达的阳性率为64.1%(59/92),显著高于癌旁正常组8%(2/25)(P<0.001).MMP14阳性率与NSCLC的分化程度、T分期、淋巴结转移和TNM分期相关(P<0.05),而与性别、年龄、吸烟及组织学类型无关(P>0.05).Kaplan-meier生存曲线显示,MMP14阳性表达组的患者5年生存期显著低于阴性表达组(P=0.004).Cox多因素回归分析显示,MMP14不是NSCLC的独立预后因素(P>0.05).MMP14在肺癌的分化、浸润和转移中扮演着重要的作用,并对生存期有一定的影响.     

HSP27 特异性shRNA 表达载体的构建及在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株 SW1990/Gem 中的表达

目的:构建HSP27基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体及观察其在耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem中的表达,为进一步探索肿瘤的基因治疗打下前期基础。方法:参考文献及shRNA设计原则,设计并合成2条能转录shRNA的DNA序列,退火连接后,插入含绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因和U6启动子的真核表达载体pRNAT-U6.3中,构建重组载体pRNAT-shHSP27。重组载体经鉴定后转染SW1990/Gem,倒置荧光显微镜观察转染情况,RT-PCR、Western Blot从mRNA及蛋白水平探讨转染对耐吉西他滨人胰腺癌细胞株SW1990/Gem的影响。结果:成功构建了针对HSP27基因的shRNA表达载体。倒置荧光显微镜下显示转染48h后SW1990/Gem细胞内存在GFP表达。RT-PCR、WesternBlot结果提示转染后HSP27的mRNA及蛋白表达水平较对照组有明显抑制(P<0.05)。结论:成功构建针对HSP27基因的特异性shRNA真核表达载体,转染细胞后可抑制HSP27表达,为进一步研究HSP27与胰腺癌生物学行为及化疗耐药等相关性奠定了基础。     

乳腺癌腋窝淋巴结清扫术后上肢淋巴水肿的危险因素分析

目的:上肢淋巴结水肿是乳腺癌腋窝淋巴结清扫术后的常见并发症,研究上肢水肿发生的危险因素有助于降低乳腺癌术后上肢淋巴结水肿的发生率.方法:随机选取114例行腋窝淋巴结清扫术的乳腺癌患者,随访并统计与腋窝淋巴结清扫术后上肢水肿相关的因素.结果:术后放疗(OR=9.233)、感染或积液导致的延迟愈合(OR=8.225)、高血压病(OR=6.977)、糖尿病(OR=5.648)是导致术后同侧上肢水肿的相关危险因素,上肢功能恢复性锻炼(OR=0.156)是术后上肢水肿的保护性因素.结论:术后是否放疗、感染或积液导致的延迟愈合、高血压病、糖尿病是导致术后同侧上肢水肿的相关危险因素,积极的上肢功能锻炼可以预防淋巴结清扫术后同侧上肢淋巴水肿的发生.     

双极电凝和缝合止血法对腹腔镜子宫全切术患者卵巢功能的影响

目的:对比和探讨双极电凝和缝合止血法对腹腔镜子宫切除术患者卵巢功能的影响.方法:所有患者均于全麻后常规行腹腔镜下子宫切除手术,并进行止血处理.研究组患者均采用双极电凝止血法,对照组患者均行缝合止血法.结果:两组患者术前激素水平各指标无显著差异(P＞0.05),术后1个月和3个月FSH、LH、INHB、E2研究组与对照组比较具有显著差异(P＜0.05).结论:双极电凝法和缝合止血法对患者的卵巢功能均有影响,但双极电凝法的损伤程度更大.     

Spd浸种对盐胁迫下番茄（Solanum lycopersicum)幼苗的保护效应

通过水培试验,研究了100 mmol/L NaCl盐浓度下,0.25 mmol/L Spd浸种处理对两个番茄品种白果强丰(耐盐基因型)和江蔬14号(盐敏感基因型)植株干重、根冠比(R/T)、幼苗叶片和根系抗氧化酶活性及活性氧含量的影响.具体试验处理如下:(a) 对照(蒸馏水浸种+ 0 mmol/L NaCl),(b) NaCl (蒸馏水浸种+ 100 mmol/L NaCl),(c) Spd(0.25 mmol/L Spd浸种 +100 mmol/L NaCl).结果表明,在盐胁迫下,两个番茄品种幼苗叶片和根系内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性升高,H2O2含量和O·-2产生速率增高,幼苗生长受到抑制,幼苗地上部、地下部干重均明显低于对照,R/T增大,且江蔬14号的变化幅度大于白果强丰.Spd浸种处理降低了盐胁迫下番茄幼苗叶片和根系内O·-2产生速率和H2O2含量,进一步提高了SOD、POD和CAT活性,促进幼苗干重增加,缓解了盐胁迫对植株的伤害.与耐盐基因型番茄品种白果强丰相比,Spd浸种处理对盐敏感基因型番茄品种江蔬14号的作用效果更为明显.总之,Spd浸种处理通过提高盐胁迫下植株体内抗氧化酶活性,降低ROS水平来缓解盐胁迫对番茄幼苗的伤害,提高幼苗耐盐能力.     

滇东南壮族社区森林资源管理分析

采用民族植物学、社会学以及牛态学调查方法,对云南马关县卢差冲壮族社区(11个样地)的森林资源状况和不同管理方式进行了研究和分析.结果表明,壮族"龙山"森林文化促进了当地社区森林和生态环境的维持和保护,具有重要的传统文化意义;"龙山"林样地的物种多样性和均匀度高于其他样地,其乔木层的平均胸径、平均高度和木材蓄积量等明显优于其他社区森林.喀斯特山地森林物种多样性较低,但该社区将其划为集体林、风景林和水土保持林进行严格保护,对维持社区生态环境良性发展具有重要作用.社区农户在管理和利用自留山森林资源方而形成了多种管理模式,主要包括常规管理、择伐与选择性管理、粗放式管理以及强度管理,其中择伐与选择性管理模式能获得较高的木材产量,有利于社区森林资源的可持续利用,是值得推广的管理方式.     

薰衣草引种育苗栽培技术

在介绍薰衣草引种概况和生物生态学特征的基础上,对其种子处理、育苗技术、栽培技术和苗期管理反越冬管护等进行了详细阐述,并对其在甘肃引种栽培的可行性进行了探讨。