干扰素诱导Mx—Cre转基因小鼠表达的重组酶活性的体外检测

利用PCR、Western blot、免疫组化、免疫金标电镜、Southern blot从DNA水平,蛋白水平分析干扰素诱导后Mx-Cre转基因小鼠肝组织中Cre重组酶的表达及其表达产物的活性,在对Mx-Cre转基因小鼠基因组中整合有cre基因进行确定后,通过干扰素诱导Mx-Cre转基因小鼠表达Cre重组酶,结果表明转基因小鼠肝细胞核和细胞质中均有Cre重组酶的表达,并在超微水平进一步证实,将含表达的Cre重组酶的肝细胞核抽提液加入到带有loxP位点的DNA中进行重组,分析证明Mx-Cre转基因小鼠表达的Cre重组酶具有重组活性,从而建立了体外检测Mx-Cre转基因re重组酶活性的方法。     

乙型肝炎病毒3’末端缺失的preS/S基因在转基因小鼠中的表达

从乙型肝炎病毒 ａｄｒ亚型的基因组 ＤＮＡ中分离 ３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的 ＤＮＡ片段,构建了由ＣＭＶ启动子控制的真核表达载体。采用受精卵显微注射方法,获得了基因组整合有３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的２个转基因小鼠品系。在不同的时间点采取血清进行了ＥＬＩＳＡ分析,发现在这２个小鼠品系中３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因可被表达,而且呈稳定状态。此小鼠品系的建立,对于探讨乙型肝炎病毒３’末端缺失的ｐｒｅＳ／Ｓ基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间的关系有重要意义。     

乙型肝炎病毒B基因组在转基因小鼠内的表达和复制

采用受精卵显微注射方法,产生了41只整合有完整的乙型肝炎病毒(HBV)B基因组的转基因小鼠建立者。建立者基因组中所整合的HBV基因组都能以孟德尔方式向后代传递。在这些建立者中,有33只为HBsAg阳性,同时也为HBeAg阳性的有18只。对血清HBsAg和HBeAg同时阳性的8只小鼠进行免疫组化分析,发现在它们的肝和肾组织中也有HBsAg和HBeAg的存在,但不存在于脾、脑、肺、睾丸、皮呋、卵巢及肌肉组织中。进而又采用了     

活体生物发光与荧光成像技术在干细胞研究中的应用

活体生物发光与荧光成像技术是近年发展起来的新兴技术,以其操作简便、灵敏度高、创伤性小在生命科学研究中有着较大的优势,目前已被广泛应用于基因标记、细胞凋亡、免疫细胞研究、肿瘤转移等诸多领域,尤其在新兴的干细胞研究方面更是发挥着不可替代的作用。综述了活体生物发光与荧光成像技术的原理、优势、应用范围及发展前景,特别对近年来该技术在胚胎干细胞的肝向分化、人造血干细胞重建小鼠造血系统、神经祖细胞治疗中枢神经系统肿瘤等方面的应用做了详细介绍。     

MAPPING重组噬菌体中插入片段的“分/合”策略

随着胚胎干细胞基因打靶技术不断推广应用,如何有效地从小鼠基因组DNA文库中筛选得到基因组DNA并进行结构分析(如限制性内切酶酶切图谱分析,即mapping等)已成为一个被普遍关心的问题.设计应用了“分/合”的策略,即先对重组噬菌体插入片段制备一套亚克隆,在对亚克隆进行详细的mapping的基础上,再对完整的大分子噬菌体DNA进行酶切分析,将两者相结合,可以分析得到完整的酶切图谱.应用此策略,简便准确地对所克隆的含有小鼠凝血因子IX基因组DNA的大分子插入片段进行了限制性内切酶酶切图谱分析,结果得到了DNA印迹等的验证.     

DNA修复酶系统的研究 Ⅱ.紫外线和丝裂霉素C诱发着色性干皮病外周血淋巴细胞的姐妹染色单体互换的观察

本文报告4例着色性干皮病病人和3例正常人外周血淋巴细胞经紫外线照射和/或丝裂霉素C处理诱发SCE的观察结果。经紫外线照射的3例着色性干皮病病人淋巴细胞的诱发SCE频率比未照射的自发SCE频率均有显著增高(P<0.01),而正常人的淋巴细胞经紫外线照射诱发的SCE频率与未照射的自发SCE频率之间无显著差异(P>0.05)。经丝裂霉素C处理的2例着色性干皮病病人和1例正常人淋巴细胞的诱发SCE频率比未处理的自发SCE频率均有明显增加,但病人的增加幅度显著大于正常人(P<0.01)。结果表明,这4例着色性干皮病病人都存在着DNA切除修复功能缺陷。此外,还发现分离淋巴细胞的自发SCE频率比微量全血培养的显著地高(P<0.01)。     

标准化嵌合体制备体系的研究

目的:完善和规范基因剔除小鼠技术体系的关键技术环节,建立一套高效的嵌合体制备体系。方法:优化胚胎干细胞(ES细胞)的基本培养条件;应用条件培养液筛选、富集高嵌合潜能的ES细胞;成熟嵌合体的制备技术;改变胚胎的移植方式,改善受体的生理状态。结果:ES细胞基本培养条件的优化及条件培养液的筛选保持了ES细胞的整体高嵌合潜能,嵌合体制备技术得以成熟,胚胎移植方式的改变提高了移植胚胎的产仔率,这些措施大大提高了嵌合体的制备效率。结论:通过对基因剔除小鼠技术体系的关键技术环节进行优化和改进,建立了一套高效的嵌合体制备程序,为基因剔除小鼠服务体系的开展打下了坚实的基础。     

乙型肝炎病毒蛋白和绿色荧光蛋白的共表达研究

目的：构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记的乙型肝炎病毒（HBV）真核表达载体,并研究其在真核细胞和小鼠体内的共表达。方法：以质粒pBR322-HBVadr2．0和pCX-EGFP为基础,构建含有双拷贝HBV全基因组DNA和EGFP基因的真核表达载体pCX-EGFP-HBVadr2．0,分别转染真核细胞和小鼠肝组织,建立体外、体内表达系统,研究GFP和HBV基因的表达。结果：构建了真核表达载体pCX-EGFP-HBVadr2．0,EGFP和HBV病毒蛋白在体内和体外均可表达。结论：构建的pCX-EGFP-HBVadr2．0真核表达载体可以GFP作为HBV存在与否的报告基因,提高了培育检测转基因小鼠的效率,为转基因小鼠的制备及后续研究奠定了基础。     

小鼠受精卵、卵裂球和桑椹胚细胞无SP表型

SP(side population)表型的概念在干细胞研究中用来表示某些细胞具有的将进入细胞的荧光染料如Hoechst 33342排出细胞的特性, 这种表型的形成与ABCG2蛋白有关. 近年研究报告某些干细胞及某些前体细胞具有SP表型, 并提出SP表型可能是干细胞或前体细胞的筛选标志. 在本研究中通过分离了小鼠受精卵、2细胞期及8细胞期卵裂球、桑椹胚和囊胚并直接进行Hoechst 33342染色, 结果发现小鼠受精卵、卵裂球、桑椹胚细胞都不具有SP表型, 但是处于其分化下游的囊胚中的内细胞团细胞却具有明显的SP表型, 而同一囊胚中的滋养层细胞却不具有SP表型. 该结果表明来源于内细胞团的胚胎干细胞具有的SP表型是内在的, 与体外培养条件无关; 另一方面该结果也提示SP表型至少是多能干细胞所具有的独特表型之一, 但并不存在于更早期的全能干细胞. 当在培养液中加入ABCG2蛋白抑制剂后直接导致囊胚中的内细胞团细胞SP表型消失, 提示囊胚内细胞团细胞SP表型的形成与ABCG2蛋白具有密切相关性. 以上结果表明并不是所有的干细胞都具有SP表型, SP表型可能可以作为某些种类的干细胞, 如胚胎干细胞及某些成体组织干细胞的分选标志, 但并不具有普遍性.     

DNA修复酶系统的研究——Ⅰ.紫外线诱发~3H-TdR在着色性干皮病淋巴细胞中的非合成期掺入

本文报告了用液体闪烁计数方法对5例华东地区的着色性干皮病病人外周血淋巴细胞进行DNA切除修复功能的研究。结果发现,这5例病人淋巴细胞中的DNA切除修复功能都有不同程度的缺陷。3例病人为正常人的50％左右,1例为正常人的15％,1例在正常人的5％以下。作者提出了紫外线诱发淋巴细胞非合成期~3H-TdR掺入指数的大小代表DNA切除修复功能的高低,并根据实验结果与临床资料分析,认为DNA修复的程度与着色性干皮病的病情进展可能存在着直接关系。这与Takebe(1978)的结论是一致的。