农杆菌介导的绿木霉遗传转化及重寄生缺陷突变体的筛选

绿木霉(Trichoderma virens)是一种重要菌寄生真菌,该菌已广泛应用于多种病害的生物防治上。本研究构建了双元载体pCATPH-I(GenBank登录号为：KC252999),并利用该载体成功实现了农杆菌介导的绿木霉遗传转化,转化效率可达385~460个转化子/106绿木霉分生孢子。转化子的PCR和遗传稳定性分析表明, T-DNA已整合进该菌的基因组中且在无选择压力的条件下能够稳定遗传。利用该转化体系成功建立了超过2000个转化子的转化子库,通过转化子与病原真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)对峙培养在该转化子库中成功筛选到两个重寄生缺陷突变体,D441和A281。本研究的完成可为绿木霉的功能基因组学及重寄生分子机制的研究打下基础。     

神经粘附分子NCAM140基因RNA干扰质粒的构建与鉴定

目的：构建有效的小鼠神经粘附分子（NCAMl40）基因的RNA干扰（RNAi）质粒载体,为研究NCAMl40参与的细胞信号通j咯转导、其生物学作用以及以NCAMl40为靶点的基因治疗提供稳定转染的RNAi质粒。方法：使用基因序列软件设计、筛选符合公开文献筛选参数的4条靶序列以及1条阴性对照序列,由上海吉玛技术有限公司合成。与载体质粒pGPU6／GFP／Neo重组后．分别命名为pSi—ncal、pSi—nca2、pSi-nca3、pSi—nca4和pSi—control。转染大肠杆菌感受态细胞。选择阳性克隆进行DNA测序鉴定,、qCestemblot方法进行干扰靶点的筛选。选取干扰效率最高的质粒转染MN9D细胞,普通光学显微镜分别计数同一视野细胞总数及GFP阳性细胞数,计算转染效率。结果：酶切和DNA测序结果证实shRNA正确插入pGPU6／GFP／Neo质粒;Westernblot结果显示与空质粒对照组比较,pSi—nca4组细胞NCAMl40表达明显下调,细胞转染效率为62％。结论：成功构建靶向小鼠NCAMl40基因的RNAi质粒,为NCAMl40参与的细胞信号通路的研究以及以NCAMl40为靶点的基因治疗提供了稳定转染：细胞的干扰质粒,为研究其生物学作用奠定了分子生物学基础。     

井冈山血水草种群遗传多样性的RAPD分析

采用RAPD技术对江西省井冈山5个血水草种群进行了遗传多样性研究。从50条随机引物中筛选出16条随机引物对血水草的90个个体进行了扩增,共得到180条可统计条带,其中156条为多态带,占总条带数的85.56%。根据Shannon指数和Nei’s遗传分化指数分析显示5个种群间的遗传多样性为31.50%、遗传分化系数为0.302 9,表明血水草大部分遗传变异存在于种群内,少部分存在种群间。血水草的基因流（Nm）为1.150 8。采用算数平均数的非加权成组配对法（UPMGA）对Nei’s的一致度进行的聚类分析结果显示梨坪种群和水口种群的遗传距离最近（0.120 9）,茨坪种群和荆竹山种群的遗传距离最远（0.234 9）。Mantel相关性分析结果显示血水草种群间的遗传距离不仅与海拔梯度有关,还与其生境有关。     

施肥对巢湖流域稻季氨挥发损失的影响

采用通气法对巢湖流域稻季土壤氨挥发原位监测,研究了不同施肥量及秸秆还田处理对稻季氨挥发的影响。结果表明,氨挥发峰值发生在施肥后的第1-3 天,氨挥发损失主要集中于施肥后的1周。2010年整个稻季氨挥发净损失量为7.22-14.20 kg/hm²,占氮肥施用量的4.59%-6.64%,基肥期是主要的氨挥发时期,约占总氨挥发量的60%,穗肥期氨挥发总损失量最小。常规施肥处理氨挥发总损失量最大,与常规施肥相比,优化施肥、减量化施肥均能减少稻田土壤氨挥发损失1%-2%,氮磷肥减量同时秸秆还田处理氨挥发量最小,其总氨挥发量占常规处理的54%。施肥后的1-2d内田面水中的NH₄⁺-N浓度达到最大值,且各施肥处理的氨挥发量与同期田面水中的NH₄⁺-N浓度呈线性正相关。结合经济效益和环境效应分析发现,秸秆还田处理可减少氨挥发损失,同时获得较高的经济效益,适宜在巢湖流域水稻季推广。     

3种雌雄异熟樟科植物开花动态的比较研究

为了解樟科植物雌雄异熟的繁育系统特点,对3种樟科植物阴香(Cinnamomum burmannii)、紫楠(Phoebe sheareri)和浙江楠(Phoebe chekiangensis)雌雄异熟花的开花动态进行了比较研究.结果表明,3种植物雌性功能期的开始时间、雌性功能期和雄性功能期的时间分配有差异.3种植物的主...     

一种核糖体展示单链抗体文库的构建与鉴定

用柑桔溃疡病致病菌Xanthomonas axonopodis pv. citri（Xac）全菌免疫小鼠,提取小鼠脾细胞mRNA,RT-PCR扩增小鼠抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）,采用linker (Gly4Ser)3连接VH和VL,构建用于核糖体展示方法筛选阳性单链抗体（scFvs）的文库。通过将scFv文库DNA转化大肠杆菌JM109,随机挑取克隆子测序以分析单链抗体文库的多样性。结果显示,用柑桔溃疡病菌免疫后的小鼠抗血清效价为2500倍左右,扩增的VH大小为350bp左右,VL的大小为650bp左右,linker连接后的单链抗体文库DNA大小为1200bp左右。测序结果显示,单链抗体文库多样性好。以Xac为靶,筛选到了抗Xac的特异性抗体,说明该抗体库可用于柑桔溃疡病菌单链抗体的筛选。     

上海崇明东滩互花米草种子产量及其萌发对温度的响应

外来物种互花米草通过快速的无性和有性繁殖,已在崇明东滩形成了大面积的单优势种群。研究了崇明东滩互花米草入侵区种子产量及温度对其萌发的影响。结果表明,互花米草在潮间带的中潮间带种子产量最高,为44523粒/m²,高潮间带次之,为31150粒/m²,低潮间带最低,为17250粒/m²。各潮间带的种子在10 30℃范围内均能萌发,而且随着温度的升高,萌发率和萌发速度总体呈现先增大后减小的趋势。互花米草种子在25℃恒温与20/30℃变温处理下的萌发率最高和萌发速度最快,而且互花米草种子在变温环境下的萌发率高于恒温处理。研究表明,崇明东滩中潮间带互花米草的种子产量和活性最高,是提供有性扩散种源的主要区域,适合种子萌发温度的4-5月是互花米草进行有性扩散的主要季节。研究结果对了解互花米草有性繁殖扩散的时空格局和入侵生态学过程,以及有效控制和管理入侵物种互花米草提供了科学依据。     

文库筛选与分子进化的核糖体展示新方法

利用适当的文库筛选技术快速、简便地从DNA文库、随机肽库、抗体库或其它蛋白文库中筛选生物活性物质是目前分子生物学研究的一个热点.核糖体展示是一种完全离体进行的功能蛋白筛选和进化鉴定的新技术,避免了传统的活体筛选技术的缺陷,使得文库容量增大、分子多样性加强.本文系统地评述了核糖体展示技术在制备ScFv单链抗体方面的应用,包括ScFv单链抗体模板的构建、体外转录与体外翻译、亲和筛选及筛选效率的测定以及分子多样性和体外进化研究,讨论了核糖体展示技术目前的发展动态、存在问题及发展趋势.     

应用荧光原位杂交检测人凝血因子Ⅸ在转基因小鼠染色体上的整合

应用荧光原位杂交（FISH）技术检测两个转基因小鼠家系从F1到F4代的整合情况。阳性转基因小鼠98%~100%的中期分裂相,85%~94%的间期核出现杂交信号;阴性对照小鼠100%的中期分裂相、95%~96%的间期核未出现杂交信号。结果表明,该FISH实验条件能对转基因整合位点进行高效特异检测。本文分析的两家系转基因小鼠均为单位点整合, 但整合位点不同。各家系内F1到F4代的转基因小鼠均可检出整合染色体,且整合位点相同,表明外源基因稳定整合并遗传给后代。 Abstract:Fluorescence in situ hybridization （FISH） was used to detect the integration of hFⅨ on chromosomes of transgenic mice from F1 to F4 generation in two strains.For transgenic mice,98%~100% of metaphases and 85%~94% of interphases showed hybridization signal.For negative control mice,100% of metaphases and 95%~96% of interphases showed no hybridization signal.The results demonstrated that FISH developed to detect the integration sites of hFⅨ was high efficient and specific.The integration sites of the transgenic mice analyzed were both single but different between the two strains.The integration chromosomes can be found in the transgenic mice from F1 to F4 generation and the integration sites were the same as each of the strains,which indicated that the transgene was stably integrated and transmitted to offspring.     

光对植物线粒体磷酸化活力及耗氧的影响

Gordon等(1960)曾报道红光和远红光对燕麦线粒体氧化磷酸化活力有抑制作用。但是,我们在膜的组合实验中却发现光下较暗中都有一定磷酸化脉冲增益。当线粒体经蔗糖密度梯度提纯后或经低渗溶液涨破离心提纯后,这种光下增益仍可观察到(表1)。因而在氧化磷酸化反应条件下了解光对线粒体的增益效应,照光30秒转暗可以看到增益甚高(表3)。说明光有触发效应。连续照光2分钟较之照光30秒后转暗90秒的处理效应反低,而不同光波下都有这种现象。说明光可能又有抑制效应(表5)。比较不同波长光的增益效应时,红光和远红光都有促进,而红光效应最高(表4、5)。与Gordon等结果不同。 线粒体基础耗氧(State Ⅱ)受光的促进,照光30秒大于连续照光的增益效应(比较图2—A、B、C)。说明光有触发效应和抑制效应。当偶联磷酸化后(State Ⅲ),光的触发效应仍存在,但此时的抑制效应不甚明显(比较图2—A、B、C偶联磷酸化部分)。所以光对嵴膜小囊的影响在耗氧和偶联磷酸化反应上并不相同。