翘嘴鲌Sox9基因的克隆及CpG岛甲基化与基因表达的关系

为了揭示翘嘴鲌(Culter alburnus)性别决定与分化的作用机制, 进而更好地发展性别控制育种技术, 研究重点分析了Sox9基因在翘嘴鲌性腺分化过程中的作用。通过RT-PCR和RACE方法获得了翘嘴鲌2个旁系同源基因Sox9a和Sox9b的cDNA序列: Sox9a全长1642 bp, 编码458个氨基酸; Sox9b全长1673 bp, 编码456个氨基酸。序列分析表明两者相似度达到73.95%, 编码HMG盒区域极其保守。蛋白质次级结构预测显示Sox9a和Sox9b除了保守的HMG盒结构域外, 还存在2个核定位信号; 两者的三维结构都存在多个螺旋结构。系统进化树分析发现翘嘴鲌Sox9a与罗非鱼关系最近, 但Sox9b形成单独的一支。利用实时荧光定量PCR技术分析了翘嘴鲌Sox9a和Sox9b基因在各成体组织中的表达水平, 结果显示Sox9a在脑和精巢中表达量最高, 其次是肌肉、鳍条、眼睛和卵巢, 在肾脏、脾脏、肝脏中相对较低; Sox9b只在脑、鳍条、眼睛和精巢中检测到一定水平的表达。通过重亚硫酸氢盐DNA测序方法分析了翘嘴鲌性腺组织Sox9a启动子CpG岛甲基化修饰模式, 结果显示在精巢中CG位点几乎不发生甲基化, 然而卵巢中的甲基化程度非常高。这些结果表明启动子CpG甲基化可以调控Sox9a的性别异形表达, 表观遗传修饰在翘嘴鲌性腺发育过程中可能具有重要的生物学功能。     

异源精子遗传物质对雌核发育草鱼基因组的影响分析

为分析外源精子对人工诱导雌核发育草鱼基因组的影响,用随机扩增多态性和微卫星技术对经两代连续人工诱导,遗传背景一致的雌核发育草鱼以及母本草鱼和父本鲤鱼的基因组DNA进行了比较分析。10个随机引物在雌核发育草鱼中共检测到104个RAPD位点,在鲤鱼中检测到103个位点。7对微卫星引物在雌核发育草鱼中共扩增出4个微卫星位点,在鲤鱼中检测到22个位点。两种方法在雌核发育草鱼和鲤鱼中所检测到的位点均没有一个相同。根据RAPD和微卫星分析数据进行的遗传相似度分析表明二代人工雌核发育草鱼群体与其一代人工诱导雌核发育草鱼母本的遗传相似度从0.9903到1.000,与父本鲤鱼的遗传相似度为0.000。这些实验结果证明在适当的紫外线处理强度下,鲤鱼精子的遗传物质能够被完全破坏,不会对雌核发育草鱼的基因组造成遗传污染。     

雌核发育草鱼同工酶分析

运用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,分析了雌核发育草鱼尾鳍中LDH、EST、SOD三种同工酶的酶谱。研究结果表明雌核发育草鱼各个体间及与普通草鱼与LDH、EST同工酶谱上表达是一致的。雌核发育草鱼中SOD酶谱与普通草鱼存在有明显差异。在雌核发育草鱼SOD酶谱区段1中检测到一条特殊的酶带(暂称之为SOD-G),SOD-G在所检测的6尾雌核发育草鱼中普遍存在,但在普通草中未检测到,初步认为SOD-G可以作为雌核发育草鱼群体的生化遗传标记。     

草鱼线粒体型超氧化物歧化酶的生化遗传特性

超氧化物歧化酶 (SOD)是一种对生物细胞保护至关重要、在进化上比较保守的酶。因此 ,超氧化物歧化酶作为分子钟或分子标记已被广泛应用于生物进化研究、群体遗传结构分析以及品系鉴定。但鱼类SOD的生物化学和遗传学特性都尚未进行过系统和深入的研究。为使这一重要的分子标记能更好地应用于鱼类遗传育种、种质资源保护以及进化研究 ,本实验采用聚丙烯酰胺梯度凝胶垂直电泳法 ,研究了草鱼线粒体型超氧化物歧化酶 (fm SOD)的同功酶形式 ,生化遗传表型、亚基组成以及金属类型。实验结果表明 ,草鱼fm SOD有三种不同的同功酶形式 ;按从正极到负极的排列分别命名为fm SOD 1 ,fm SOD 2 ,fm SOD 3。这三种不同的fm SOD在草鱼群体中可构成 3种不同的生化遗传学表型 :表型 1个体只含有迁移率最快的fm SOD 1同功酶 ;表型3个体只含有迁移率最慢的fm SOD 3同功酶 ;而表型 2个体中含有所有三种不同形式的同功酶。在野生草鱼群体中 ,存在所有三种表现型 ;而在基因纯合型的雌核发育草鱼群体中只检测到表型 1和表型 3。野生草鱼群体中三种表现型的个体数之比符合一对等位基因分离的 1∶2∶1孟德尔遗传分离比例。由这些实验结果得出以下结论 :(1 )草鱼fm SOD是由细胞核DNA上的基因所编码而不是由线粒体DNA上的基因所编码的     

草鱼RAGs的克隆及不同发育阶段的表达分析

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)在1、2龄阶段的抗病能力很差,但到3龄阶段后义具有了很强的抗病能力,提示草鱼的免疫系统可能要到3龄发育阶段才会完善.重组激活基因(Recombination activating genes,RAGs)编码的蛋白质专一性介导淋巴细胞抗原识别受体基因的V(D)J重组,在脊椎动物淋巴细胞正常发育成熟过程中起关键作用.为了进一步研究草鱼免疫系统建立和完善的发育遗传学因素,通过PCR方法克隆了草鱼重组激活基因rag1和rag2,分析了它们在不同发育阶段的表达.草鱼rag1基因从起始密码到终止密码总长4188 bp,由三个外显子和两个内含子组成,其开放阅读框长3192 bp,编码1063个氨基酸.草鱼rag2基因从起始密码到终止密码总长1593bp,没有内含子,编码530个氨基酸.氨基酸序列比对分析表明,预测的草鱼RAG1和RAG2蛋白的功能区域与其他脊椎动物的相应功能区具有很高的同源性.从受精后第4天开始,RT-PCR即可检测到rag1基因的表达,在随后的幼鱼阶段rag1基因维持了高水平的表达.在1龄草鱼的头肾中仍可以检测到rag1基因的表达,但在3龄草鱼头肾中没有检测到rag1基因的表达.这些结果表明草鱼从胚胎的孵化期开始到1龄幼鱼阶段是免疫球蛋白(Ig)和T细胞受体(TCR)V(D)J重组的活跃时期,在3龄发育阶段其淋巴细胞系中V(D)J重组活动已经很少,免疫系统中Ig和TCR库的多样化过程趋于完成,其免疫系统已经比较完善.