应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系

[目的]探索应用pIRES2-EGFP表达载体快速建立Hela细胞稳转细胞系的筛选方法。[方法]EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切,T4 DNA连接酶连接构建目的基因p IRES2-EGFP表达载体并测序确定,Lipofectamine3000转染Hela细胞分为Mock组(未转染组)、NC组(p IRES2-EGFP空载对照组)、重组质粒转染组,转染后24 h消化细胞进行初步筛选(900μg/m LG418),转染后14～16 d将长至肉眼可见的细胞克隆全部重新消化进行二次筛选(方法同初步筛选),转染后28～32 d挑选3个肉眼可见的细胞克隆,实时荧光定量PCR和WB检测目的基因过表达效率。[结果]双酶切及测序确定重组质粒成功构建,与Mock组相比,NC组无明显变化,重组质粒转染组各克隆目的基因mRNA水平分别升高109±8. 3、127±10. 5、122±9. 1倍,P 0. 01,蛋白水平分别升高33±3. 3、45±4. 7、47±4. 9倍,P 0. 01。[结论]该筛选方法 28～32d左右可快速建立Hela细胞稳转细胞系,过表达效率高,可直接进行后续实验。     

Ridaifen-G诱导细胞死亡不依赖于细胞凋亡蛋白酶(英文)

通过对Ridaifen-G(RID-G)诱导造血细胞U937、Raji、THP-1和IM-9死亡是否需要Z-VAD-fmk(一种细胞凋亡蛋白酶抑制剂)的研究,发现RID-G以细胞凋亡蛋白酶非依存性的方式诱导细胞死亡,并伴随有线粒体功能紊乱。Z-VAD-fmk对U937细胞的死亡没有影响,但抑制etoposide诱导的细胞凋亡;DNA片段化结果表明,RID-G可破坏Raji和THP-1细胞的DNA,经RID-G处理后的U937细胞的DNA条带没有经etoposide处理的清晰。此外,Z-VAD-fmk对U937、THP-1和Raji细胞DNA的片段化程度有不同的影响,抑制细胞死亡。这些结果表明,RID-G诱导的非典型细胞死亡不依赖于caspase,且伴随有线粒体功能紊乱。     

腹腔镜肝癌切除术对肝细胞癌中的治疗效果及对血清AFP、sEC、HGF、ICAM-1的影响

目的:研究腹腔镜肝癌切除术对肝细胞癌中的治疗效果及对血清AFP、sEC、HGF、ICAM-1的影响。方法:选择2012年3月至2017年3月在我院接受治疗的肝细胞癌患者196例,根据治疗方案不同分为观察组和对照组,对照组给予开腹切除术治疗,观察组给予腹腔镜切除术治疗。观察并比较两组手术前后血清甲胎蛋白(AFP)、sEC、人类生长因子(HGF)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)及总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、谷丙转氨酶(ALT)及白蛋白(Alb)水平,术中出血量、术后绝对卧床时间、住院时间以及并发症发生率。结果:术后,观察组血清AFP、sEC、HGF、ICAM-1水平均明显低于对照组(P0.05);观察组TBIL、DBIL、ALT水平均显著低于对照组,Alb则显著高于对照组(P0.05);观察组术中出血量、绝对卧床时间以及住院时间均明显低于对照组(P0.05);且观察组术后并发症发生率明显低于对照组(P0.05)。结论:使用腹腔镜肝癌切除术治疗肝细胞癌,可降低患者血清AFP、sEC、HGF、ICAM-1水平从而提高其治疗效果,且术后并发症发生率较低。     

Vsig4 和免疫球蛋白Fc段融合蛋白的真核表达纯化

目的:本项目将通过构建中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)真核表达系统获取小鼠Vsig4膜外端和免疫球蛋白Ig G3a-Fc段的融合蛋白,鉴定Vsig4-Fc和Vsig4纳米抗体的相互作用。方法:采用重合延伸PCR法融合小鼠Ig G3a-Fc和Vsig4胞外段的基因序列,将该融合基因插入真核表达载体中并转染CHO细胞。Western blotting鉴定转染细胞上清中的目标蛋白,通过连续两次亚克隆筛选,获得高表达小鼠Vsig4-Fc融合蛋白的单克隆,之后大量培养增殖转染细胞并收集细胞培养上清,选择Protein A柱纯化方法纯化Vsig4-Fc蛋白,最后经ELISA法鉴定Vsig4-Fc和纳米抗体的结合能力。结果:在CHO细胞中成功构建了小鼠Vsig4-Fc真核表达稳转系,并且在真核表达体系中获得可表达15 mg/L的双分子结构Vsig4-Fc的稳定转染细胞系。经鉴定小鼠Vsig4-Fc融合蛋白能与Vsig4纳米抗体结合。结论:重合延伸PCR法使得Vsig4和Fc基因片段的融合更为高效,两次亚克隆筛选优势细胞系大幅提高了真核蛋白的表达量,为进一步研究Vsig4的生物学功能奠定重要基础。     

同型半胱氨酸水平与女性绝经期骨质疏松相关性研究

目的:通过分析女性绝经期不同骨密度人群的血浆同型半胱氨酸(HCY)指标,探讨同型半胱氨酸在女性绝经期骨质疏松发生过程中的作用及其潜在的临床价值。方法:收集2014年3月至2016年3月我院体检中心进行体检的女性绝经期妇女(60岁)血样标本共计625例,根据体检的骨密度报告对其进行分组,骨质疏松组215例,骨量减少组309例,骨量正常组101例,测量每组的同型半胱氨酸水平。结果:骨密度程度与同型半胱氨酸水平存在负相关关系(rs=-0.763,P=0.046),三组之间的同型半胱氨酸水平也存在显著差异(F=4.807,P0.016),其中骨质疏松组指标最高,骨量正常组指标最低。结论:同型半胱氨酸是重要的骨代谢指标,在衡量绝经期妇女骨质疏松进展中具有重要的意义。     

维生素C衍生物对癌细胞浸润转移能力的抑制作用机理研究

前期研究表明Asc2P6P1m能够有效地抑制癌细胞的浸润转移。本文试图以Asc2P6P1m对人成纤维瘤细胞浸润转移作用探讨维生素C衍生物对癌细胞转移能力抑制的机理。对HT-1080细胞分别以50—300μmol/LAsc2P6P1m处理1h,随着Asc2P6P1m浓度的增大,细胞移动的数目明显减少,Asc2P6P1m对HT-1080细胞移动的抑制作用呈现出量效关系。Asc2P6P1m对ROS的清除作用,通过自旋捕集剂DMPO以电子自旋共振方法进行研究。HT-1080细胞经Asc2P6P1m处理后,细胞内的自由基水平与对照组相比有显著的降低。用F-actin的分子探针NBD研究表明,随处理时间延长,细胞内荧光强度与对照组相比显著降低。Western blots研究表明,细胞核内的RhoA蛋白量随Asc2P6P1m处理时间延长而逐渐增加。研究提示,Asc2P6P1m对癌细胞浸润转移能力的抑制作用是与抑制癌细胞内的ROS、提高细胞核内RhoA水平、降低细胞质内F-actin相关。     

15-HETE参与的脑缺血再灌注损伤中p-ERK1/2表达变化的研究

目的:通过应用15-脂氧化酶(15-Lipoxygenase,15-LOX)抑制剂去甲二氢愈创木酸(nordihydroguaiaretic acid,NDGA)抑制15-羟基-二十碳四烯酸(15-hydroxyeicosatetraenoic acid,15-HETE)的生成,观察缺血再灌注损伤中大鼠脑组织磷酸化细胞外信号调节酶(phosphor-extracellular signal-regulated kinase,p-ERK1/2)表达的变化,探讨p-ERK1/2在15-HETE参与的脑缺血再灌注损伤中的作用及其表达变化。方法:应用大脑中动脉线栓栓塞法(MCAO)制作大鼠脑梗死2小时再灌注模型。将大鼠随机分为三组:假手术组(sham组)、DMSO对照组、NDGA处理组。后两组再根据不同的灌注时间分为三个亚组:再灌注1小时组、再灌注6小时组、再灌注24小时组。采用TTC染色法检测再灌注24小时大鼠脑梗死体积;免疫印迹(Western blot)法测定梗死后再灌注不同时间点梗死核心区和梗死周围区的p-ERK1/2的表达。结果:假手术组仅有少量p-ERK1/2的表达。DMSO对照组梗死核心区p-ERK1/2的表达从梗死再灌注后1小时即开始逐渐升高(1.43±0.06),6小时达高峰(2.02±0.14),24小时有所下降(1.16±0.21),与假手术组(0.62±0.08)比较P值均0.01;梗死周围区p-ERK1/2表现出相同的变化趋势。与DMSO对照组比较,NDGA处理组大鼠脑梗死体积显著减小(20.10±0.12%vs 17.24±0.16%,P=0.009,P0.05),各时间点p-ERK1/2的表达均下降。与梗死核心区相比较,梗死周围区24小时仍可检测到较高含量的p-ERK1/2(1.16±0.21 vs 1.86±0.14),但梗死核心区表达相对较少。结论:脑缺血再灌注损伤中,p-ERK1/2的表达增加,说明p-ERK1/2参与其中;应用NDGA后,p-ERK1/2的表达降低,脑梗死体积减小,证实p-ERK1/2参与了15-HETE介导的脑缺血再灌注损伤,并在此过程中可能参与了细胞的凋亡。     

不同剂量丙种球蛋白联合地塞米松治疗儿童特发性血小板减少性紫癜的疗效观察

目的:探讨不同剂量丙种球蛋白联合地塞米松治疗儿童特发性血小板减少性紫癜(ITP)的临床疗效。方法:选择2010年7月至2015年7月间我院收治的特发性血小板减少性紫癜患儿78例,按照随机数字表法将其分为观察组38例及对照组40例。观察组采用200 mg/(kg·d)丙种球蛋白联合地塞米松进行治疗,对照组采用400 mg/(kg·d)丙种球蛋白联合地塞米松进行治疗。对两组患者的临床疗效、治疗前后血小板计数、血小板上升时间、血小板恢复正常时间、出血停止时间、住院时间、不良反应及医疗费用进行观察。结果:两组患儿血小板计数治疗前无显著差异(P0.05),治疗后两组血小板计数均呈逐渐升高趋势(P0.05),但组间比较无统计学差异(P0.05)。两组患儿血小板上升时间、血小板恢复正常时间、出血停止时间及住院时间均接近,无统计学差异(P0.05)。观察组治疗总有效率为94.74%,对照组为95.00%,两组无显著差异(P0.05)。观察组不良反应发生率为8.17%,对照组为12.50%,两者相比无统计学差异(P0.05)。观察组患儿平均医疗费用为(1.25±0.34)万元,对照组患儿平均医疗费用为(2.31±0.40)万元,观察组明显低于对照组,两者差异有统计学意义(P0.05)。结论:不同剂量丙种球蛋白联合地塞米松治疗ITP具有类似的临床疗效及安全性,但小剂量丙种球蛋白组治疗费用明显降低,因此值得临床推广应用。     

黑翅土白蚁巢群觅食群体大小与工蚁体长呈正相关

【目的】明确黑翅土白蚁Odontotermes formosanus巢群的觅食群体大小与工蚁体长之间的关系,为进一步研究其生态学特点以及更好地开展防治提供依据。【方法】在杭州植物园内选择5处有黑翅土白蚁活动区域作试验点,诱捕并以中性红(neutral red)标记捕获的白蚁工蚁,通过“捕获-标记-释放-重捕”试验测定黑翅土白蚁的觅食群体大小。【结果】5个试验点中有4个成功实施了“捕获-标记-释放-重捕”试验,4个试验点黑翅土白蚁巢群的觅食群体个体数量分别为443 133±45 469, 495 360±67 429, 674 345±101 703和1 224 662±93 112头。黑翅土白蚁觅食群体大小(Y)与觅食工蚁的体长(X)呈正相关,拟合的指数函数方程式为：Y=1.8389e^0.7185X(R²=0.7834)。【结论】本研究明确了黑翅土白蚁的觅食群体大小以及工蚁体长之间的函数关系,为开展区域防治提供了依据。     

羊水胆碱酯酶凝胶圆盘电泳改良法及其产前诊断神经管缺损的应用

本文在羊水胆碱酯酶凝胶圆盘电泳中,改用亚铁氰化铜的棕色显带沉淀反应,使显带比原法清晰,温培时间由12小时以上缩短为3小时。测定了210例正常的和19例神经管缺损畸胎的妊娠羊水,其阴性和阳性期望率分别达97.1％和100％。