表达O型口蹄疫病毒保护性抗原表位重组PRRSV的构建及其鉴定

以高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的感染性分子克隆(rHuN4-F112)作为载体,将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因的421~480nt(141~160aa)和598~639nt(200~213aa)两优势保护性抗原表位串联成的目的基因,通过突变PCR的方法插入Nsp2中的508~532位缺失区域,经体外转录后转染至BHK-21细胞中培养36 h,将上清接种至MARC-145细胞中培养,并在MARC-145细胞中连续传代,拯救重组病毒。经RT-PCR扩增,MluⅠ酶切及测序验证,结果表明插入的外源基因及人为突变的MluⅠ分子标记都正确,说明重组病毒拯救成功,且该重组病毒能够在MARC-145细胞中稳定传代,将此重组病毒命名为rPRRSV-F112-O/VP1ep。rPRRSV-F112-O/VP1ep能够在MARC-145细胞上引起明显的细胞病变,间接免疫荧光检测表明外源基因在该病毒中成功获得了表达。经过生物学特性分析,该病毒的TCID50=-log10-6.75/0.1 mL,且在MARC-145细胞中整体生长速度与其亲本病毒rHuN4-F112(△508-532)相似,但明显高于rHuN4-F112病毒。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特性分析

将猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）CH-1a株GP5基因插入到伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）Bartha-K61株TK基因中,获得了一株TK^-／gE^-表型的重组伪狂犬病病毒,命名为rPRV—GP5。经生长动力学、表达动力学和间接免疫荧光证实PRRSV GP5在重组病毒中获得了表达,表达蛋白的抗原性与亲本病毒相似,rPRV-GP5在不同的细胞上毒价和细胞病变与Bartha—K61比较无显著差异。4只PRV抗体阴性的绵羊,每只接种10^6.0。PFU的rPRV-GP5可以完全抵抗10^3LD50伪狂犬病强毒S株的攻击。10头PRV、PRRSV抗体阴性的仔猪滴鼻接种rPRV-GP5 10^7.0 PFU／头并在接种后63d攻击PRRSV CH-1a株10^5.0 TCID50／头,攻毒后3d和5d出现了PRRSV荧光抗体和ELISA抗体,在政毒后14d检测到了PRRSV中和抗体,Bartha—K61活疫苗组和对照组至实验结束时仍未检测到PRRSV中和抗体。这说明rPRV-GP5免疫产生了针对PRRSV的回忆性免疫应答。     

用噬菌体随机肽库筛选SARS冠状病毒S蛋白单克隆抗体2C5的模拟表位

SARS-CoVS蛋白特异的单克隆抗体2C5具有病毒中和作用。以单克隆抗体2C5为筛选靶分子,筛选噬菌体展示随机7肽库。经三轮淘洗后随机挑选20个噬菌体克隆进行ELISA分析和序列测定。在10个ELISAOD值大于0.2的阳性噬菌体克隆中,有8个噬菌体克隆展示有共同的7肽序列TPEQQFT。展示有该序列的噬菌体克隆能竞争抑制SARS-CoVS蛋白抗原与单抗2C5的结合。结果表明TPEQQFT为单克隆抗体2C5的模拟表位。该结果可对进一步研究S蛋白结构与功能和设计SARS疫苗有一定的参考意义。     

应用套式PCR选择性卡他热病毒在不同动物体内变异的研究

应用本实验建立的三组套式ＰＣＲ（ＰＣＲ１、２、３）和一组以前报道的套式ＰＣＲ（ＰＣＲ４）,对５９份外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）ＤＮＡ样品进行了恶性卡他病毒核酸序列的检测。这些样品来自５１只羊,以及与羊接触而发病的６头牛和２只鹿。除ＰＣＲ４外,其它三组ＰＣＲ都能扩增现有４个角马型ＭＣＦＶ分离株。有６只羊在４组ＰＣＲ中都呈阴性,其余５３份样品经ＰＣＲ４检测均呈阳性。ＰＣＲ１只有从４５只羊体检出ＭＣＦＶＤＮ     

流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附、融合,决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿主产生保护性免疫反应中起重要作用.E蛋白结构域Ⅲ(EⅢ)是诱导中和抗体的重要区域.为确定乙型脑炎EⅢ的抗原表位,实验首先克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的EⅢ区域,并用pGEX-6P-1载体进行融合表达,免疫印迹分析表明,该融合蛋白能被抗JEV血清识别.为了进一步对该结构域进行抗原表位作图,设计了14个覆盖该区域且部分重叠的短肽.将各短肽与GST进行融合表达与纯化.短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹和EUSA免疫反应性扫描分析,结果鉴定出,E39(306TEKFSFAKNPVDTGHG320)、EA5-l(355VTNPFVATSSA366)、FA8-1(377FGDSYIV384)和E49(385VGRGDKQINHHWHKAG400)4个线性抗原表位.分别将4个抗原表位融合蛋白免疫小鼠,制备各抗原表位单因子血清,结果经体外病毒中和试验表明,E39为具有病毒中和活性的抗原表位.试验结果为进一步分析JEVE蛋白结构与功能以及诊断试剂和表位疫苗的研究提供了重要工作基础.     

传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因在重组禽痘病毒中共表达

在重组禽痘病毒中表达多个禽类病原的主要免疫原基因是构建多价基因工程疫苗的前提 ,但相关研究很少。在表达传染性喉气管炎病毒 (ILTV)gB基因重组禽痘病毒的转移载体的基础上 ,构建了含有ILTVgB基因和新城疫病毒 (NDV)F基因的重组禽痘病毒转移载体pSY-gB-F ,采用脂质体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维 (CEF)细胞后 ,通过蓝斑试验筛选出重组禽痘病毒 (rFPV-gB-F) ,并进行了 6轮蚀斑纯化。Western blot试验和间接免疫荧光试验证明ILTVgB基因和NDVF基因在rFPV-gB-F感染的CEF细胞中获得表达。为传染性喉气管炎、新城疫与鸡痘活载体多价疫苗的研制奠定基础。     

传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因在重组禽痘病毒中共表达

在重组禽痘病毒中表达多个禽类病原的主要免疫原基因是构建多价基因工程疫苗的前提,但相关研究很少。在表达传染性喉气管炎病毒(ILTV)gB基因重组禽痘病毒的转移载体的基础上,构建了含有ILTV gB基因和新城疫病毒(NDV)F基因的重组禽痘病毒转移载体pSY-gB-F,采用脂质体转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维(CEF)细胞后,通过蓝斑试验筛选出重组禽痘病毒(rFPv-gB-F),并进行了6轮蚀斑纯化。Western-blot试验和间接免疫荧光试验证明ILTV gB基因和NBVF基因在rFPV-gB-F感染的CEF细胞中获得表达。为传染性喉气管炎、新城疫与鸡痘活载体多价疫苗的研制奠定基础。     

新型兽用疫苗的研究进展

新型兽用疫苗是免疫学和病毒学的研究热点,主要包括亚单位疫苗、基因工程缺失苗、重组病毒活载体疫苗和基因疫苗。上前已经被广泛的应用于研究和疫病的防治上。最近的疫苗发展方向集中于在基因疫苗上。高效、安全、稳定、成本低是疫苗开发的重点。本文介绍了新型疫苗的现状,以及今后发展的趋势和策略。     

泛素基因介导下的猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因对小鼠的免疫试验

摘要：【目的】获得猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, PRRSV）M蛋白基因及其与泛素（Ubiquitin, Ub）基因融合的真核表达质粒,并进一步研究Ub对M基因免疫效果的影响。【方法】利用RT-PCR技术以PRRSV CH-1a株和BALB/c小鼠脾脏组织总RNA为模板,分别扩增出PRRSV M蛋白基因与小鼠的Ub基因,利用SOE技术将PRRSV M基因与小鼠Ub基因进行融合,最终构建真核表达质粒pVAX1-M与pVAX1-U-M。以两种真核表达质粒DNA肌肉免疫BALB/c小鼠后,分别检测体液免疫反应与细胞免疫反应,比较M单基因与Ub-M融合基因DNA免疫所诱生的免疫应答强度【结果】IFA试验表明,pVAX1-M与pVAX1-U-M均能BHK-21细胞内成功表达目的基因;两种重组质粒免疫小鼠后均可诱生PRRSV ELISA抗体与细胞免疫反应,但是pVAX1-U-M诱导的细胞免疫反应明显高于pVAX1-M,差异显著（P<0.05）;而其诱导的抗体水平明显低于pVAX1-M,二者差异也显著（P<0.05）。【结论】泛素在一定程度上可以促进PRRSV M基因诱导细胞免疫反应,但对体液免疫未见到同样作用。     

重组细胞高产型H3N2猪流感病毒株的拯救

为拯救出一株能够在动物传代细胞中高水平复制的H3N2亚型猪流感疫苗株,利用反向遗传操作技术,将A/Goose/Dalian/3/01(H9N2)毒株的PB1、PA、NP、M、NS基因和A/PR/8/34毒株的PB2基因作为内部基因与猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)毒株的HA、NA基因进行重组,成功拯救出了具有高度细胞适应性毒株rH3N2株,该毒株接毒MDCK细胞60h后,血凝价可以达到1∶512,表明该毒株具有高度适应细胞繁殖特性,为H3N2亚型猪流感病毒细胞培养型疫苗的研制奠定了基础。