蛇毒锯鳞蝰素融合蛋白的发酵与纯化

研究大肠杆菌表达重组蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin,Ecs)融合蛋白的发酵和纯化工艺。将Ecs基因插入表达载体pTXB1,转化E.coliBL21(DE3)构建工程菌。对工程菌进行补料分批培养并诱导表达,研究培养基、培养和诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响,几丁质亲和层析纯化Ecs融合蛋白,经DTT裂解后,检测Ecs活性。发酵后菌体湿重可达75g/L,融合蛋白表达量约占总蛋白的35%,重组质粒在BL21宿主菌中传代稳定。亲和层析纯化后,得到Ecs单体,得率为28mg/L发酵液。生物学活性分析显示,重组Ecs能有效抑制血小板的聚集,其活性与天然Ecs相似。优化了Ecs融合基因工程菌的发酵和纯化条件,为规模化生产奠定基础。     

将RGD模体改变为RGDNM可减弱Echistatin对血小板聚集的抑制但增强血管新生的抑制作用

为了研究去整合素echistatin RGD(Arg-Gly-Asp) 模体周边氨基酸突变后对其生物学功能的影响,根据echistatin序列设计合成6个片段,利用重叠延伸PCR法合成cDNA,使echistatin RGD模体周边序列变为ARGDNM (D27→N),与载体pTXB1连接后转化E.coli BL21(DE3),建立echistatin (ARGDNM)的表达体系．工程菌经IPTG诱导后融合蛋白表达量占菌体总蛋白约30%,几丁质亲和纯化后,DTT裂解释放目的蛋白分子量约5.4 kD．体外血小板聚集和体内鸡胚绒毛尿囊膜 (chick chorioallantoic membrane, CAM)血管新生实验结果表明,echistatin (ARGDNM)抑制血小板聚集的作用减弱,而其抑制血管新生的作用增强．RGD模体周围氨基酸的改变影响了去整合素的生物学功能,echistatin (ARGDNM)增强了与αⅤβ3结合的特异性,本工作为研究特异性更强的去整合素药物奠定了基础．     

人胰岛素突变体GIRR的分离纯化及性质研究

构建人胰岛素原突变体GIRR(A2 1Asn→Gly,B1 7Leu→Ile ,B31Arg ,B32Arg)基因的原核融合表达载体并进行表达和纯化 ,进一步对其性质进行研究。将人胰岛素原突变体基因重组到pTXB1融合表达载体上 ,在E .coliBL2 1 (DE3)中得到高效表达。表达产物经几丁质亲和柱层析分离以及胰蛋白酶和羧肽酶B的酶促转化等步骤 ,得到纯的人胰岛素突变体GIRR ,其纯度经HPLC鉴定达到 95 % ,氨基酸组成和设计相符 ,其受体结合活性是猪胰岛素的 1 0 5 % ,生物活性为 2 6.8IU/mg。其血浆半衰期为 2 0分钟 ,比标准猪胰岛素提高 3倍多。结果提示本突变体具有更长的半衰期 ,为长效胰岛素的制备提供了新的思路。     

肝细胞特异性基因治疗载体的构建及活性研究

以细胞膜穿透肽 (Penetratin)基因为主要模板序列 ,融合肝细胞膜受体结合蛋白的DNA序列 ,设计一段肝细胞基因治疗载体的特异基因序列 ,构建并表达了肝细胞特异性载体体系及 3种对照体系。然后进行肝细胞的穿膜实验 ,细胞荧光显色结果提示肝细胞特异性载体体系可以有效地介导外源蛋白EGFP的基因进入肝细胞 ,并在肝细胞内表达。结论提示 ,所构建的载体体系有可能为肝细胞基因治疗提供一种新型的非病毒基因治疗载体。     

抗TNF-α单链抗体噬菌体展示文库的建立和鉴定

应用噬菌体展示技术构建抗肿瘤坏死因子α(tumornecrosis factor α,TNF-α)单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,从中筛选抗TNF-αscFv并进行鉴定.利用重组人TNF-α(rhTNF-α)免疫小鼠,分别扩增小鼠VH和VL基因,经重叠延伸反应将VH和VL基因拼接成scFv基因,以SfiⅠ/NotⅠ位点定向插入pCANTAB 5E噬菌粒载体,转化E.coli TG1,构建了库容为4.6×108的抗TNF-α单链抗体库.对抗体库进行3轮富集筛选后,ELISA检测阳性克隆的抗原特异性,取1株阳性克隆进行测序分析.结果表明,抗TNF-αscFv基因序列长774bp,编码258个氨基酸.将此阳性克隆转化E.coliHB2151,IPTG诱导可溶性scFv的表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析,scFv的分子量约为28kD.经亲和纯化后的scFv可与rhTNF-α结合,并可中和由rhTNF-α引起的L929细胞毒性.本文利用噬菌体抗体库筛选到了高亲和力的抗TNF-αscFv,为研制临床免疫治疗的新型抗体奠定了实验基础.