SARS-CoV中和抗体保护恒河猴等感染SARS-CoV研究

[目的]阐明SARS病毒感染后能否再次感染,疫苗产生的抗体中长期保护效果,被动免疫是否真正安全有效等,为防治SARS提供实验依据。[方法]实验分4组,分别为一组(SARS恒河猴恢复组):用感染SARS-CoV发病12月后的4只恒河猴,均有中和抗体产生。二组(SARS食蟹猴恢复组):用感染SARS-CoV发病12月后的3只食蟹猴,均有中和抗体产生。三组(SARS血清输入恒河猴组):3只恒河猴,病毒接种时中和抗体阴性。病毒接种两天后输入抗体阳性血清(恒河猴血清,感染获得,效价为:1:128),用量10ml/只,分别经肌肉和静脉输入,各5ml。四组(恒河猴SARS-CoV感染组):2只恒河猴,病毒接种时中和抗体阴性。SARSCo-V经鼻腔接种,在感染的第1天开始到7天安乐死时,不同时间取咽拭子、血液和脏器,进行病毒分离,RT-PCR检测和中和抗体测定。[结果]一组(SARS恒河猴恢复组):接种SARS-CoV后未见发热等异常临床表现。血清生化无ALT、LDH、CK、总蛋白和血清白蛋白异常。3只猴在接种病毒后的咽拭子中,RT-PCR分别未检出、第1天检出、第1-3天中检出病毒。第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。2只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎。二组(SARS食蟹猴恢复组):接种3只未见任何不良临床表现,血清生化5项正常。3只猴在接种病毒后的咽拭子标本中,RT-PCR分别未检出SARS病毒、在第1-2天检出、在第1-3天中检出病毒。第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。3只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎等。三组(SARS血清输入恒河猴组):3只恒河猴在病毒接种的第2-5天时有一过性的体温升高,3940℃。血清生化5项正常。3只猴在接种病毒后的咽拭子标本中,RT-PCR分别在第1-3、第1-4天和第1-2天检出SARS病毒。2只猴第7天咽拭子中病毒分离阳性。另外1只在第2、5、7天咽拭子中、7天安乐死时血、肺、肝、脾和淋巴结等组织中病毒分离均为阴性。3只猴肺组织病理学检查见轻度肺炎等。四组(SARS恒河猴SARS-CoV感染组):2只猴病毒接种后,第2-4天时有一过性的体温升高,3940℃。2只进行接种病毒后1-7天安乐死时,RT-PCR在恒河猴的咽拭子标本中连续检出SARS病毒。在第2、5天咽拭子中、7天安乐死时肺组织中病毒分离阳性。2只猴肺等组织病理学检查发现肺组织表面局部有轻度发灰实变现象,可见到间质性肺炎病变,内皮细胞受损,出血和水肿。大多数肺泡没有完整的内衬细胞残留,肺泡间隔变宽并被以吞噬细胞为主的单核炎症细胞浸润,同SARS肺炎改变。实验表明,前期感染产生中和抗体的恒河猴、食蟹猴再次感染病毒,和模型对照猴比较,动物肺组织等只出现轻微或无病理变化,RT-PCR检出时间大大缩短,病毒培养未能分离出病毒,所有这些指标,均证实中和抗体有明显的保护作用,是有效的。被动免疫从结果来看,有一定的作用,但保护作用弱。     

帕金森病α-Synuclein转基因小鼠模型中G蛋白偶联受体激酶5的表达

目的观测G蛋白偶联受体激酶5（G protein-coupled receptor kinase,GRK5）在帕金森病α-synuclein转基因小鼠模型中的表达变化情况,了解GRK5在帕金森病中的可能作用,为发现帕金森病发病机制和探索更好的治疗方法提供新的方向。方法采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术对具有不同的人alpha synuclein（hα--syn）表达水平的帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠以及3月龄,6月龄以及9月龄A53T突变型帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠脑组织进行GRK5的RNA和蛋白水平检测,与同窝阴性对照小鼠进行比较。结果各组帕金森病α-synuclein转基因小鼠与阴性对照小鼠相比,GRK5蛋白表达水平均有不同程度的增加,并且随着转入的hα--syn蛋白表达水平的高低而有所变化。3月龄和6月龄帕金森病转基因模型小鼠与同月龄阴性对照组小鼠相比,GRK5的mRNA和蛋白水平没有变化;而9月龄帕金森病转基因模型小鼠与同月龄阴性对照组小鼠相比,GRK5的mRNA和蛋白水平都有所增加。结论帕金森病α-synuclein转基因模型小鼠具有更高表达水平的GRK5。     

甲型H1N1流感病毒在季流病毒、禽流感病毒共感染时变异可能性的验证

目的 甲型H1N1流感病毒A/California/7/2009分别与A/Brisbane/10/07和A/ShenZhen/406H/06共感染小型香猪,预测甲流病毒在与季流H3N2病毒/甲流病毒与禽流感病毒共感染时是否会发生变异.方法 分别将A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2),A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)对5～6月龄小型猪共感染,小型猪经复方氯胺酮0.1 mL/kg麻醉后进行滴鼻感染,感染后第5天安乐死动物,取动物肺组织作病毒测序分析.结果 A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2)共感染后,A/California/7/2009病毒PB1基因993位G→A突变,PA基因1659位G→A突变,没有氨基酸的变异.A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)共感染后A/California/7/2009病毒PB2基因1711位T→C突变.碱基的突变未引起氨基酸的变异.结论 A/California/7/2009(CA7)与A/Brisbane/10/07(H3N2),A/California/7/2009与A/Shenzhen/406H/06(H5N1)共感染后在猪的体内没有发生病毒重组、变异.     

上肢精准测试系统在食蟹猴脑缺血研究中的应用

目的使用上肢精准测试系统对脊髓间充质干细胞治疗脑缺血的疗效进行行为学分析评价。方法成年食蟹猴18只,手术前2个月用上肢精准测试系统对动物进行训练并采集本底数据。采用光化学法制作局部脑缺血模型,造模后4周将动物随机分为对照组、干细胞治疗高剂量组和低剂量组,分别在缺血灶周围注射生理盐水、脊髓间充质干细胞5×106/只和1×106/只,造模后1 d、3 d、1、2、3、4周及干细胞注射后1d、3 d、1、2、3、4、5、6、8周采集行为学实验数据。比较造模前后和干细胞注射前后动物受损伤侧上肢抓取水果块的时间,结合神经功能评分评价造模和干细胞治疗效果。结果 18只动物手术后均出现与梗死部位对应的行为学症状。在术后采集数据的各个时间点损伤侧上肢行为学数据与手术前差异均存在极显著性（P〈0.01）。神经功能评分术后24 h最高,随后出现渐进性恢复。干细胞治疗后3 d到治疗后第8周,模型组动物与高、低剂量组动物间精准上肢运动测试结果差异均存在显著性（P〈0.05）。神经功能评分在治疗2周后出现显著性差异（P〈0.05）。高、低剂量组间差异未见显著性。结论上肢精准测试系统能客观准确的反应动物神经功能,在非人灵长类脑卒中动物模型建立和药效学评价方面有广泛应用前景。     

食蟹猴脑出血模型的建立及评价

目的建立稳定的食蟹猴自体股动脉抗凝血脑出血模型。方法健康成年食蟹猴8只,采用新鲜抗凝自体股动脉血1．5mL,立体定向一次性缓慢匀速注入右侧基底节区屏状核内侧,利用MRI、PET、神经功能缺损评分和组织病理学对模型进行评价。结果动物在麻醉苏醒后出现了与血肿部位相对应的神经系统定位体征,影像学检查血肿腔位于右侧基底节,注血部位大片代谢缺损区,中线向左侧移位。组织病理学检查损伤局部周围可见多量泡沫细胞、淋巴细胞及单核巨噬细胞浸润,部分损伤脑组织已被肉芽组织机化。结论自体股动脉抗凝血定向脑内注射法可建立稳定、可靠的食蟹猴脑出血模型,注血量、注血部位和速度是模型成功与否的关键。     

猴免疫缺陷病毒（SIV）猴模型的建立

应用ＳＩＶｍａｃ毒株感染中国恒河猴１３只,感染剂量为病毒液的１０－１～２×１０－５;感染食蟹猴４只,感染剂量为１０－２。感染后２周出现各种症状和体征如皮疹,浅表淋巴结肿大,脾肿大,血象白细胞总数下降,出现异常淋巴细胞和中性白细胞。感染后期Ｔ４下降,Ｔ４、Ｔ８比例倒置等。从外周血淋巴细胞和血浆分离病毒阳性,血清抗体上升。淋巴结组织切片呈规律性改变,即淋巴滤泡增生－滤泡耗竭－淋巴组织耗竭或逐渐恢复。感染后２．５个月有急性死亡病例,以后呈散在死亡例,尸检还发现机遇性感染如肺寄生虫,肺、肝巨细胞病毒感染等。     

ACE2在SARS发病中作用的研究进展

重症急性呼吸综合征（SARS）是由SARS冠状病毒（SARS-CoV）引起的一种急性传染病,在其序列被测出后几个月内人们就找到了SARS-CoV的受体血管紧张素转换酶2（ACE2）。因病毒受体与病毒入侵细胞密切相关,因而有必要深入研究ACE2与SARS-CoV之间的关系。本文总结了ACE2在各组织器官的分布及功能,分析了ACE2基因的变异与病毒进入及SARS疾病严重程度之间的关系、ACE2基因的表达水平与病毒进入及SARS疾病严重程度之间的关系。这些研究将为理解SARS-CoV与ACE2之间的相互作用及设计针对ACE2的抗SARS药物提供重要的理论依据。     

牛磺胆酸作用下副溶血弧菌全基因组比较转录谱的表达分析

目的利用DNA芯片技术研究副溶血弧菌对牛磺胆酸刺激反应的全局性基因转录变化概况,找出其中的表达调控变化规律,为副溶血弧菌基因转录调控网络的构建提供实验和理论依据。方法副溶血弧菌分别在正常和添加了50mmol／L牛磺胆酸的培养基中孵育至对数中期,收集菌体,提取RNA,利用全基因组DNA芯片分析比较两者基因转录变化。并应用聚类分析比较其中的变化规律。结果比较转录谱分析证实一共有255个基因的转录表达发生显著性变化,和对照组相比,上调的基因明显占主导优势。而在这些变化的基因中,关于蛋白合成和硫代谢以及谷氨酸合成相关的基因均呈现明显的转录上调变化。结论我们利用DNA芯片技术描绘出了副溶血弧菌在添加牛磺胆酸后全部基因转录水平变化的概图,并发现了蛋白合成,硫代谢和谷氨酸合成相关的基因的变化规律,这给我们下一步的转录调控网络研究提供了良好的靶标。     

长爪沙鼠IgG的纯化及抗血清的制备

目的 纯化长爪沙鼠血清IgG,制备兔抗长爪沙鼠IgG抗血清。方法 采用Hitrap Protein G亲和层析预装柱来纯化长爪沙鼠血清IgG;通过SDS-PAGE电泳和Western-Blotting免疫印迹法对长爪沙鼠血清IgG进行纯度鉴定,免疫兔子制备抗血清。结果 7 mL长爪沙鼠血清纯化得到11 mg IgG;电泳和免疫印迹测定,IgG纯度大于95%;用纯化的IgG作抗原制备了兔抗血清,免疫双扩散测定效价达1∶32。结论 建立了长爪沙鼠血清IgG的纯化方法,制备了长爪沙鼠IgG抗血清,证实长爪沙鼠血清IgG和Protein G具有较高的亲和性。     

H7N9禽流感病毒与其他流感病毒对雪貂致病性与传播力的比较

目的针对2013年3月中国爆发的人感染H7N9禽流感病毒,在雪貂体内进行致病性及传播力的研究,并与甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒进行比较。方法对新发H7N9毒株、甲型H1N1流感病毒、H5N1禽流感病毒感染雪貂后的临床症状、体征,呼吸道排毒情况,组织病理学变化等进行评价和比较,并对H7N9毒株在雪貂群体中的传播力进行研究。结果雪貂模型的临床症状、死亡率、病毒传播以及组织病理学分析显示:H7N9病毒的致病性低于H5N1,与2009年起源于北美的甲型H1N1流感病毒相当。新发H7N9禽流感病毒可以在雪貂的呼吸道、心脏、肝脏以及嗅球进行复制。值得注意的是H7N9禽流感可以通过飞沫在雪貂间进行低水平的传播,并且在传播过程中,病毒基因组内有多个位点的氨基酸发生了替换。结论 H7N9禽流感病毒对雪貂的致病性较H5N1禽流感病毒低,与甲型H1N1流感病毒对雪貂的致病性相当,H7N9禽流感病毒可在雪貂间进行传播。