敲除组蛋白去乙酰化酶基因hdac对里氏木霉纤维素酶表达的调控作用

[背景]里氏木霉(Trichoderma reesei)是木霉属中产纤维素酶最具代表性的真菌之一,表观遗传调控是不涉及DNA序列变化的可遗传变化,组蛋白去乙酰化是其中一种。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)负责脱乙酰化,敲除去乙酰化酶基因可引起菌株孢子、菌丝及纤维素酶活性等的一系列改变。[目的]通过敲除里氏木霉组蛋白去乙酰化酶基因(histone deacetylase,hdac)建立了里氏木霉hdac缺失突变株(T.reesei△hdac),以研究对纤维素酶基因表达的调控作用。[方法]利用Split-Maker技术构建了组蛋白去乙酰化酶基因敲除表达盒,并转化了里氏木霉T.reesei QM9414。经PCR及Southern blotting验证正确后,对突变体T.reesei△hdac连续7 d检测滤纸酶活(filter paper activity,AFP)、羧甲基纤维素钠酶活(carboxymethyl cellulase activity,CMCA),利用RT-qPCR检测纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的表达。[结果]突变体T.reesei△hdac两种酶活力均显著高于出发菌株,分别高出8.00、30.00 IU/mL。突变体T.reesei△hdac纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的转录水平分别为出发菌株T.reesei QM9414的6.50、6.01和4.51倍。[结论]里氏木霉中纤维素酶的基因表达明显受到组蛋白去乙酰化酶基因(hdac)的调控,这为研究里氏木霉表观遗传调控对纤维素酶的影响提供了新的证据。     

siRNA介导多药耐药相关蛋白(MRP1)的表达沉默

利用pSIREN-RetroQ载体构建了3个沉默多药耐药相关蛋白（MRP1）基因表达质粒pSI REN-siRNAs.并通过限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序鉴定,将截断MRP和全长MRP1 cDNA分别克隆到真核表达载体pEGFP-N2和pcDNA3.1中,产生了pEGFP-MRP1T和pcDNA-MRP1表达质粒．质粒pEGFP-MRP1T分别与3个pSIREN-siRNAs共转染HEK293细胞沉默MRP1T-GFP靶基因,pSIREN-siRNA1作为阴性对照.荧光显微镜下显示结果表明,与pSIREN-siRNA1相比,pSIREN-siRNA2和pSIREN-siRNA3产生的siRNA能够有效沉默MRP1T-GFP融合蛋白的表达．为了沉默全长MRP1基因的表达,pcDNA-MRP1分别与3个pSIREN-siRNAs共转染HEK293细胞．Western印迹和MTT分析表明,pSIREN-siRNA2和pSIREN- siRNA3能有效抑制190 kD MRP1在HEK293细胞中的表达,而pSIREN-siRNA1则不能．pSIREN-siRNA2和pSIREN-siRNA3能逆转MRP1转染HEK293细胞产生的多药耐药性．RNA二级结构预测结果分析表明,siRNA1靶序列mRNA局部自由能热动力参数ΔG低于siRNA2和siRNA3靶序列mRNA局部自由能热动力参数,siRNA1的GC含量和Tm值高于siRNA2和siRNA3．这些数据提示,siRNA和局部靶结构可能影响siRNA对MRP1 mRNA表达的沉默作用．     

丝状真菌中的RNA干扰及其应用技术

RNA干扰是真核生物中相对保守的一种基因特录后表达调控机制,它通过双链RNA介导细胞内mRNA发生特异性降解或翻译抑制,从而调控靶基因的表达.对丝状真菌中RNA压制和减数分裂沉默等现象的研究表明,与动、植物一样,丝状真菌中也存在RNA干扰现象.通过对RNA压制缺失突变株和减教分裂沉默缺失突变株的一系列分子生物学研究,获得了与之密切相关的一系列蛋白,而这些蛋白在结构和功能上与动、植物RNA干扰途径的蛋白高度相似,这些结果证明了丝状真菌中的RNA存在干扰现象.RNA干扰技术作为丝状真菌分子生物学研究或遗传改造的工具具有特殊的意义,因为丝状真菌具有多核和发生非同源重组频率高的特点,难以用基因敲除手段进行改造.系统地介绍丝状真菌中的RNA干扰途径以及使用RNA干扰对真菌进行遗传改造的方法.     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种由双链RNA诱发的转录后水平的基因沉默现象,是近几年发展起来的基因表达调节新机制。RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中,这种调控可以由siRNA、shRNA及miRNA等小分子RNA参与。在此主要对RNAi的研究进展如背景、分子调控机制、存在的问题和应用前景等进行了综述。     

敲除里氏木霉hkmt基因可增强纤维素酶的酶活性和表达水平

表观遗传是不涉及DNA序列变化的可遗传变化,包括DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA调控等。在组蛋白甲基化修饰中,主要是组蛋白赖氨酸甲基转移酶（histone lysine methyltransferase,HKMT）参与调控。有文献报道,HKMT蛋白的催化核心为SET结构域,它具有促进或抑制基因表达的作用。在里氏木霉(Trichoderma reesei)中,HKMT对纤维素酶基因的表达调控的机制尚不明确。本文阐述了以里氏木霉为研究对象,利用Split-Maker技术构建了组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因敲除表达盒,并转化了里氏木霉T. reesei QM9414。经PCR及Southern印迹验证正确后,显微镜观察到T.reesei Δhkmt菌株菌丝较长,分支较多。检测到突变体菌株连续7d滤纸酶活（filter paper enzyme activity,AFP）和羧甲基纤维素钠酶活 (carboxymethyl cellulose sodium enzyme activity,CMCA)。结果分别比野生型菌株高出5.00 IU·mL^-1、15.00 IU·mL^-1。利用RT-qPCR检测到突变菌株纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的表达分别高出野生型4.51、3.87和2.51倍。通过对野生型菌株和突变菌株形态特征、纤维素酶酶活性、纤维素酶相关基因表达量的探索,为进一步研究里氏木霉表观遗传调控对纤维素酶表达的影响提供了新思路和实验资料。     

细胞周期素与细胞周期的调控

本综述了不同细胞周期素的分子结构和对细胞周期的调控作用,在细胞周期的不同时期,周期素与P34^cdc2及其相关激酶相作用,产生特定的激酶活性,使细胞通过细胞周期特定的调控点,周期素的累积与降解对细胞周期进程的调控起着重要的作用。     

多头绒泡菌微原质团瞬时表达系统的构建

真核生物多头绒泡菌的原质团是研究细胞周期的好材料。但尚无合适的表达体系可供选择。本研究用多头绒泡菌ardC actin基因启动子和终止子分别替换哺乳动物细胞表达质粒pDsRed1-N1的CMVIE和SV40 polyA片段,构建了多头绒泡菌红色荧光蛋白(RFP)表达质粒pXM1;用PardC-MCS-DsRed1-TardC替换pTB38表达盒PardC-hph-TardC,构建了多头绒泡菌RFP表达质粒pXM2。将多头绒泡菌转录延伸因子类似蛋白(PELF1)基因与质粒pXM2重组,构建了PELF1红色荧光融合蛋白(PELF1-RFP)表达质粒pXM2-pelf1。通过荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察RFP表达发现,电转参数为4kV/cm(电场)、1A(电流)、70μs(电击时间)时,质粒pXM1和pXM2电转多头绒泡菌微原质团(≤500μm)后24～48h内,RFP荧光最显著;而PELF1-RFP则主要聚集在多头绒泡菌细胞核,说明本试验建立的表达系统可以用于研究特定蛋白在多头绒泡菌内的瞬时表达。     

敲除里氏木霉hkmt基因可增强纤维素酶的酶活性和表达水平

表观遗传是不涉及DNA序列变化的可遗传变化,包括DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA调控等。在组蛋白甲基化修饰中,主要是组蛋白赖氨酸甲基转移酶（histone lysine methyltransferase,HKMT）参与调控。有文献报道,HKMT蛋白的催化核心为SET结构域,它具有促进或抑制基因表达的作用。在里氏木霉(Trichoderma reesei)中,HKMT对纤维素酶基因的表达调控的机制尚不明确。本文阐述了以里氏木霉为研究对象,利用Split-Maker技术构建了组蛋白赖氨酸甲基转移酶基因敲除表达盒,并转化了里氏木霉T. reesei QM9414。经PCR及Southern印迹验证正确后,显微镜观察到T.reesei Δhkmt菌株菌丝较长,分支较多。检测到突变体菌株连续7d滤纸酶活（filter paper enzyme activity,AFP）和羧甲基纤维素钠酶活 (carboxymethyl cellulose sodium enzyme activity,CMCA)。结果分别比野生型菌株高出5.00 IU·mL^-1、15.00 IU·mL^-1。利用RT-qPCR检测到突变菌株纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的表达分别高出野生型4.51、3.87和2.51倍。通过对野生型菌株和突变菌株形态特征、纤维素酶酶活性、纤维素酶相关基因表达量的探索,为进一步研究里氏木霉表观遗传调控对纤维素酶表达的影响提供了新思路和实验资料。     

里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达

进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ（EGⅣ）在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中的表达。采用RT—PCR的方法从里氏木霉（Trichoderma reesei）中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris—EGⅣ1。在甲醇诱导下,重组菌株P.pastoris-EGⅣ1可以合成并分泌EGⅣ,培养液的CMC活力达到2．11U／mL。     

siRNA对多头绒泡菌丝氨酸/精氨酸蛋白激酶表达的沉默

SR蛋白激酶（serine/arginine protein-specific kinase,SRPK）是一类特异磷酸化剪接因子SR蛋白的激酶家族,可调节SR蛋白的选择型剪接,影响SR蛋白在核内的分布与定位,在pre-mRNA剪接调控上具有重要的作用。目前对于多头绒泡菌SRPK的功能仍不清楚。为了进一步研究PSRPK的功能,设计可转录小干扰RNA（siRNA）的寡核苷酸序列含U6启动子的载体pSIREN-RetroQ定向连接,构建了真核表达质粒pSIREN-PSRPK-1,pSIREN-PSRPK-2,pSIREN-PSRPK-3,pSIREN-PSRPK-4,pSIREN-PSRPK-5及对照质粒pSIREN-PSRPK-Neg。把编码PSRPK基因的cDNA与红色荧光蛋白表达载体pDsRed-N1重组,构建了表达PSRPK-红色荧光融合蛋白的表达质粒pP-SRPK-DsRed。将真核表达质粒和质粒pPSRPK-DsRed共转染HEK293细胞。转染后72h通过倒置荧光显微镜观察,结果表明,pSIREN-PSRPK-2和pSIREN-PSRPK-5可以有效沉默红色荧光融合蛋白的表达;进一步采用RT-PCR和Northern点杂交分析表明,pSIREN-PSRPK-2和pSIREN-PSRPK-5对红色荧光融合蛋白mRNA表达具有明显的抑制作用与倒置荧光显微镜下观察到的结果一致。这为进一步研究多头绒泡菌SRPK的功能奠定了实验基础。