天蚕素AD在毕赤酵母中的多拷贝整合表达及表达条件优化

【背景】天蚕素抗菌肽是目前研究最清楚、效果最显著的抗菌肽,实现工业化生产为其在农业、养殖业中的应用奠定了基础。【目的】获得一株高效生产天蚕素AD的基因工程菌株。【方法】构建重组载体pGAPZαA-CAD通过电击转化至PichiapastorisX33中,表达天蚕素AD基因并获得X33/GCAD菌株;构建重组载体pUCGAP-CAD导入至X33/GCAD菌株中。pGAPZαA-CAD是以博来霉素为抗性筛选标签被整合到P. pastoris X33的GAPDH启动子区域,pUCGAP-CAD是以遗传霉素为抗性筛选标签被整合到P. pastoris X33的非翻译rDNA区域,最终获得一株高效表达天蚕素AD的酵母菌株X33/GUCAD。【结果】通过质谱分析鉴定X33/GUCAD表达的抑菌物质为天蚕素AD,通过发酵条件的优化,表明X33/GUCAD菌株在以甘油为碳源和以蛋白胨、酵母提取物为有机氮源的情况下具有较强表达天蚕素AD的能力。【结论】较高的拷贝数更有利于提高天蚕素AD的产量,此工程菌株在后期发酵过程中稳定性较好,适于工业化生产。     

极耐盐碱固氮菌的分离鉴定及固氮特性研究

我国盐碱土面积约9913万hm²,其中pH值高于9、盐含量大于0.6%的重度盐碱地每年以1.4%的速率增长。利用固氮微生物改善植物根际环境,提高作物产量,是盐碱地改良的重要方法。[目的] 从来自海南省三沙市热带珊瑚岛礁的土壤中,分离鉴定自生固氮菌,为极端盐碱地改良提供候选菌株。[方法] 通过形态学观察、生理生化特征分析和16S rRNA序列测定等方法进行菌种鉴定,分析其固氮、耐盐碱和促生长特性,盆栽试验验证其对玉米主要农艺性状的影响。[结果] 获得1株极端耐盐碱的固氮细菌DJ-1,其菌落呈圆形,菌体杆状,大小（0.5-1.3）μm×（0.3-0.5）μm,革兰氏染色阴性,与根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的16S rRNA序列高度同源,确定其为根癌土壤杆菌。DJ-1在pH 9、NaCl含量为1%-4%的培养基上可正常生长,能耐受pH 12、NaCl含量8%的环境。从中克隆到固氮酶基因nifH。盆栽试验结果表明,DJ-1可显著促进玉米生长。[结论] 菌株DJ-1能耐受极端盐碱条件,且具有较强的固氮和促生长能力,有可能作为贫瘠盐碱耕地改良功能菌剂的候选菌株。     

湖北省鸟类新纪录 灰背伯劳

2011年7月 ~ 2012年9月,在神农架国家级自然保护区的坪阡村进行鸟类资源调查时,拍摄到一批鸟类生态照片,经鉴定其中灰背伯劳（Lanius tephronotus）为湖北省新纪录种。     

拟南芥PKS5点突变体对盐碱胁迫的响应特性

拟南芥蛋白激酶PKS5参与植物对外界的盐碱胁迫信号响应过程.为探求PKS5不同结构域对外界盐碱胁迫下的响应功能,以PKS5点突变体pks5-2、pks5-4、pks5-5、pks5-6、pks5-7、pks5-8和pks5-9为材料,分析PKS5不同点突变体在外界盐碱胁迫下的特性.结果显示:(1)pks5-2、pks5-6、pks5-7和pks5-8对外界盐碱胁迫的主根生长表型与野生型存在差异,pks5-4、pks5-5和pk5-9则无差异,其中的pks5-2和pks5-8主根生长对盐碱胁迫表现出抗性表型,而pks5-6和pks5-7表现出敏感表型.(2)当PKS5发生点突变后其突变基因的表达发生改变,与野生型基因相比,PKS5-2、PKS5-6与PKS5-7的表达均有所降低.(3) PKS5点突变蛋白的亚细胞定位与野生型相比不存在差异,在细胞核、细胞质及细胞膜中均有分布.(4)pks5各点突变体内的Na+含量在野生型与点突变体间存在显著差异,pks5-2体内的Na+含量较野生型降低,而pks5-6和pks5-7体内的Na+则升高.研究表明,PKS5不同位置点突变导致植物对外界盐碱胁迫有着不同的响应过程,预示PKS5不同的结构域在其功能上存在差异.     

pcDNA3.1(-)-Bcr-Abl及pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151突变质粒真核表达载体的构建

目的:将Bcr-Abl及Bcr-Abl T3151突变克隆入pcDNA3.1(-)真核表达载体,为研究靶向降解受体型酪氨酸激酶BCR-Abl,抑制肿瘤细胞生长提供研究基础.方法:pcDNA3.1 (-)-Bcr-Abl质粒构建:分别设计引物,通过分段PCR将BCR-ABL克隆入pcDNA3.1(-).首先通过PCR扩增出Bcr-a片段,将其克隆入pcDNA3.1(-)的NheⅠ/XhoⅠ之间;接着将PCR扩增出的Abl-c片段克隆入KpnⅠ/ HindⅢ之间,最后XhoⅠ/KpnⅠ双酶切pGD210,将酶切下片段插入pcDNA3.1(-)的相应位点即可.酶切鉴定及测序正确后,转染293T细胞,Western blot验证质粒的表达.pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的突变质粒:首先设计引物,第一步以pcDNA3.1(-)-BCR/ABL为模板,以Abl-c-u和ba-M1为引物扩增出A-1:560 bp.第二步,相同模板,以ba-M2和ba-M-down为引物扩增出A-2:870 bp.第三步,以扩增出的A-1和A-2为模板,以Abl-c-u和ba-M-down为引物,扩增出1434 bp的片段A-l+2,以Bcl和Kpn Ⅰ分别酶切pcDNA3.1 (-)-BCR/ABL以及A-1+2,将突变后的A-l+2置换入pcDNA3.1 (-)-BCR/ABL.结果:PCR结果显示3.1(-)-Bcr-Abl及3.1 (-)-Bcr-Abl T3151突变质粒条带大小符合,重组质粒经酶切鉴定和测序结果正确,转染后可见融合蛋白的表达.结论:成功构建pcDNA3.1 (-)-Bcr-Abl及pcDNA 3.1(-)-Bcr-Abl T3151的真核表达载体,并且转染293T细胞后证实其能够正确表达,为后续研究奠定了基础.     

低氧对大鼠右心室肥厚及心肌中缝隙连接蛋白43表达的影响

目的:研究低氧对大鼠右心室肥厚及心肌中缝隙连接蛋白43 (Cx43)表达的影响.方法:40只健康雄性SD大鼠随机分为正常组(control)、低氧3周组、低氧4周组和低氧5周组.除正常组外,其余3组大鼠分别在低氧环境中饲养3周、4周和5周.测定和比较各组大鼠的平均肺动脉压力(mPAP)、右心室收缩压(RVSP)、右心室肥厚度[Rv/(LV+S)％],并通过免疫组化染色法观察各组大鼠左心室心肌细胞中cx43的表达.结果:与正常组相比,低氧3周、4周、5周组大鼠的mPAP、RVSP、右心室肥厚度均显著升高(P均＜0.05),与低氧3周组比较,低氧4周、5周组大鼠的mPAP、RVSP、右心室肥厚度均显著升高(P均＜0.05),而低氧5周组大鼠的mPAP、RVSP、右心室肥厚度均显著高于低氧4周(P均＜0.05).免疫组织化学结果显示:低氧组大鼠Cx43排列紊乱,端-端连接减少,侧面连接增多;随着低氧时间的延长,大鼠心肌细胞中Cx43的表达逐渐减少,差异具有统计学意义(P均＜0.05).结论:低氧可导致右心室肥厚,并随着诱导时间的延长而逐渐加重,这可能与心肌中Cx43的分布紊乱及表达减少有关.     

侵染中华蜜蜂6日龄幼虫的蜜蜂球囊菌的微小RNA差异表达谱及调控网络

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis,简称球囊菌)是专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原。MicroRNA(miRNA)作为一类重要的基因表达调控因子,能够广泛参与真菌及其宿主的相互作用过程。本研究通过比较分析球囊菌孢子(AaCK)和侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂) 6日龄幼虫肠道内的球囊菌(AaT)的smallRNA(sRNA)组学数据对球囊菌的差异表达miRNA(differentiallyexpressed miRNA,DEmiRNA)、靶mRNA及二者间的调控网络进行全面解析,旨在揭示miRNA介导的球囊菌对中蜂幼虫的侵染机制。【方法】对于球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道的small RNA-seq (sRNA-seq)数据,利用BLAST工具连续比对东方蜜蜂(Apiscerana)和球囊菌的参考基因组筛滤得到AaT的sRNA组学数据。分别将AaCK和AaT的sRNA组学数据比对miRBase数据库,对球囊菌侵染宿主前后miRNA的数量和结构特征进行分析。联用RNAhybrid+svm_light、Miranda和TargetScan软件预测AaCK vs AaT比较组中DEmiRNA的靶mRNA,进而利用相关生物信息学软件对上述靶mRNA进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析。通过Cytoscape软件对DEmiRNA-mRNA调控网络进行可视化。利用Stem-loop RT-PCR、RT-qPCR和分子克隆验证测序结果的可靠性。【结果】在AaCK和AaT中分别鉴定到380和387个miRNA。结构特征分析结果显示,AaCK和AaT的mi RNA皆集中分布在18–25 nt,且首位碱基主要偏向于U。AaCKvsAaT比较组共有270个DEmiRNA,包含155个上调miRNA和115个下调miRNA,分别靶向结合6091和6145个mRNA。GO分类结果显示,上述靶mRNA主要涉及代谢进程、细胞进程、应激反应等15个生物学进程;细胞、细胞组分、细胞器等12个细胞组分;催化活性、结合、转运子活性等11个分子功能。KEGG代谢通路富集分析结果显示,上述靶mRNA富集在123条代谢通路,参与对氨基酸代谢、碳水化合物代谢以及核苷酸代谢等物质代谢,氧化磷酸化、硫代谢、氮代谢等能量代谢,以及MAPK和Hippo等信号通路的调控。球囊菌DEmiRNA与靶mRNA之间存在复杂的调控关系,其中miR-29-x、miR-250-x、miR-4968-y、miR-11200-x、novel-m0023-5p、novel-m0130-5p和novel-m0135-5p等DEmiRNA可靶向结合与球囊菌的半胱氨酸蛋白酶、DNA甲基化转移酶以及几丁质酶相关的mRNA;此外,miR-7-x、miR-9-z、miR-319-y和miR-5951-y等同时参与调控MAPK信号通路;进一步分析发现,miR-250-x同时参与对DNA甲基化转移酶、MAPK信号通路及其他酶类合成与代谢途径的调控,并可能参与球囊菌与中蜂6日龄幼虫之间的跨界调控。通过Stem-loopRT-PCR和RT-qPCR验证了4个DEmiRNA的差异表达,并利用分子克隆和Sanger测序证实miR-7-x的序列与测序结果一致。【结论】本研究解析了侵染中蜂6日龄幼虫的球囊菌的miRNA差异表达谱及DEmiRNA的调控网络,揭示了球囊菌DEmiRNA可能通过调控病原的物质和能量代谢、增殖、毒力、信号通路及相关mRNA参与对中蜂幼虫的侵染过程。miR-7-x、miR-250-x、novel-m0023-5p等关键DEmiRNA有望作为白垩病治疗的新型分子靶点。     

吲哚美辛栓剂对预防ERCP术后高淀粉酶血症及胰腺炎的效果观察

目的:探讨吲哚美辛栓剂对预防ERCP术后高淀粉酶血症及胰腺炎的效果。方法:选取2010年10月-2015年6月收治入院的行ERCP手术的患者300例,随机分为观察组及对照组各150例,观察患者ERCP术后立即应用吲哚美辛栓剂直肠给药,对照组给予安慰剂栓剂,术后3 h,24 h检测血清淀粉酶,观察高淀粉酶血症及胰腺炎的发生情况。结果:术前两组血清淀粉酶比较差异无统计学意义(P0.05);术后3 h,24 h两组血清淀粉酶均升高,且观察组高于对照组,差异均具有统计学意义(t=5.794、10.816,P均0.05)。观察组高淀粉酶血症及ERCP术后胰腺炎的发生率明显低于对照组,差异均具有统计学意义(x~2=5.927;2.160,P0.05)。结论:直肠给药吲哚美辛栓剂可明显降低ERCP术后血清淀粉酶量,降低高淀粉酶血症及ERCP术后胰腺炎的发生率。     

依达拉奉联合醒脑静治疗急性脑出血的临床疗效观察

目的:探究依达拉奉联合醒脑静治疗急性脑出血(ACH)的临床疗效及对炎症指标的影响。方法:本研究于2013年2月~2015年2月期间,选择我院收治的ACH患者128例为研究对象,采用随机数字法将其分为研究组(65例)和对照组(63例)。两组患者均给予一般常规治疗并给予依达拉奉,研究组患者在此基础上联用醒脑静注射液治疗。观察两组患者治疗前后炎症因子变化、采用美国国立卫生研究院的卒中量表(NIHSS)评价神经功能缺损修复情况、采用格拉斯哥昏迷评分(GCS)评价患者意识状态,并对比治疗后临床疗效。结果:治疗后两组患者C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)水平和NIHSS评分均出现明显降低(均P0.05),GCS评分均出现明显升高(P0.05),且研究组上述指标改善均优于对照组,差异均存在统计学差异(均P0.05);治疗后研究组有效率为87.69%,显著高于对照组的69.84%(X2=6.125,P=0.013)。结论:依达拉奉联合醒脑静治疗ACH,能够改善患者神经功能损伤及炎症反应,预后好,疗效确切,具有重要的临床价值。     

住院耳聋患者临床流行病学特征及疗效分析

目的:描述住院耳聋患者的临床流行病学特征及治疗效果。方法:采用描述流行病学方法,收集哈尔滨医科大学附属第二医院耳鼻喉科2010年1月-2012年12月收治的748例耳聋患者的临床资料进行统计学分析。结果:748例耳聋患者中,男性394例(52.67%),女性354例(47.33%),P=0.7391,不同年龄段性别构成无统计学差异;单耳发病占75.40%,双耳发病占24.60%,10岁以下及70岁以上的患者双侧耳聋较多;听力损失程度构成由高到低依次为:极重度199例(30.99%)、重度139例(21.65%)、中重度100例(15.58%)、轻度95例(14.80%)、中度80例(12.46%)及语频正常29例(4.52%),10岁以下较其他各年龄段发生极重度听力损失较多;伴发高血压者93例(12.43%)、糖尿病者56例(7.49%)、冠心病者48例(6.42%)、脑血管疾病者31例(4.14%);治愈145例(19.38%),好转547例(73.13%),未治愈45例(6.02%),总有效率为92.51%。结论:耳聋发病以突发性耳聋为主,年龄30-69岁居多,单侧耳聋较双侧耳聋发病多,而儿童双耳发病较多,年龄小、听力损失程度轻者预后较好,听力损失严重且预后较差。