利用根癌农杆菌T-DNA 插入突变寻找参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因

【目的】新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是人类重要致病真菌,主要毒性因子之一漆酶的表达受葡糖糖阻遏,机制未知。本文拟寻找参与葡萄糖阻遏的关键基因。【方法】建立根癌农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefanciens-mediated transformation,ATMT)建立一个容量约200000的随即插入突变文库,在高浓度葡萄糖条件下从中筛选葡萄糖去阻遏的突变株。通过Southern确定突变株中T-DNA的拷贝数,利用反向PCR获得依赖葡萄糖的漆酶阻遏基因序列。【结果】筛选到了30株葡萄糖去阻遏突变株,Southern blot发现83%的葡萄糖去抑制突变株含有单个T-DNA拷贝。初步鉴定了可能参与漆酶阻遏的10个不同生物学功能基因,如参与碳水化合物的代谢,固醇的合成,几丁质的合成,GPI脂锚钩的合成等等。【结论】ATMT突变策略可以找到一些参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因,为理解漆酶在致病过程中的作用机制和工业改进漆酶活性提供参考。     

泡桐丛枝和枣疯病植原体tuf基因上游序列结构、功能和遗传变异比较分析

【目的】探究泡桐丛枝和枣疯病植原体tuf基因上游序列结构、功能差异及其遗传多样性。【方法】利用热不对称交错式PCR(TAIL-PCR)扩增枣疯病植原体tuf基因上游未知序列,利用启动子探针载体pSUPV4构建了泡桐丛枝和枣疯病植原体tuf基因上游序列的大肠杆菌异源表达体系,分析泡桐丛枝、苦楝丛枝、莴苣黄化、桑萎缩、长春花绿变等16SrI组和枣疯病、樱桃致死黄化、重阳木丛枝等16SrV组株系tuf基因上游调控序列的遗传变异特征和启动子活性。【结果】泡桐丛枝等16SrI组植原体株系tuf基因和其上游fus A基因之间的间区序列长129-130 bp,预测有完整的启动子保守结构。泡桐丛枝植原体tuf基因上游130 bp片段具有启动子活性,此间区序列在5种35株16SrI组株系中存在4种变异类型;枣疯病植原体等16SrV组株系fusA和tuf基因间区长53-54 bp,未预测到完整启动子结构。枣疯病植原体tuf基因上游144 bp和346 bp片段均未检测到启动子活性,fus A和tuf基因间区序列在3种20株16SrV组株系中存在2种变异类型。fus A-tuf基因间区序列相对保守,基于此序列构建的进化树可清晰区分不同组别的植原体株系。【结论】研究方法和结果为深入研究植原体基因表达与调控、揭示植原体生长繁殖规律及其致病机理等奠定了良好的基础。     

新形势下开展微生物类课程教学改革的探索与实践

生物科学和生物技术专业连续数年位列高考"红牌警告"专业;互联网+的飞速发展和智能手机的广泛使用,让教师和学生可以同时获得生物科学与技术的最新研究信息。在这样的新形势下如何开展微生物类课程教学?这是每一位专业教师必须直面的课题。本文结合南开大学精品资源共享课"微生物发酵工程"的建设,结合理论教学、实验教学和实践教学"三位一体"的教学模式,谈谈我们对于微生物类课程教学的思考与实践探索。     

定陶汉墓出土汉砖表面及其储存环境真菌病害的分析与防治

【背景】定陶王墓地M2汉墓出土了一批处于防护层的重要汉砖,目前部分汉砖表面出现了真菌病害问题。【目的】根据现场文物保护状况,选取了5块汉砖表面的微生物病害样本,检测并分析了汉砖表面的真菌病害,将分离得到的7株真菌进行抑菌试验。【方法】使用扫描电镜观察、高通量测序、纯培养和抑菌试验等方法对样本中的真菌进行分析。【结果】发现未经抑菌处理的汉砖表面真菌病害问题严重,经75%乙醇和0.5%硝酸咪康唑处理过的汉砖表面真菌病害问题减弱。汉砖上的主要真菌不同,汉砖9表面含量最多的真菌为Boeremia,汉砖13表面含量最多的为虫草科(Cordycipitaceae)。然而硝酸咪康唑和硼酸硼砂并无抑菌效果,抑菌产品K100(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)具有较好的抑菌效果。【结论】本研究对分析和防治汉砖表面的真菌病害及对汉砖进行科技保护具有重要意义。     

纤维素降解球毛壳菌NK-102的高效遗传转化方法

摘要:【目的】在球毛壳菌(Chaetomium globosum)NK-102 中,建立菌株特异性转化体系。【方法】构建新的抗性标记pUCATPH-Pgap,转化效率优于pUCATPH 和pCM768。建立了PEG-原生质体和根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105 介导的两种转化方法。【结果】原生质体转化效率为30－50 个转化子/10 μg DNA,抗性标记pUCATPH-Pgap 效率最高。EHA105 介导转化率达到3.2×102 转化子/107 孢子。Sout     

石质文物微生物检测技术的研究进展

本论文针对国内外最新的石质文物微生物的检测技术进行了论述,主要包括核酸分析鉴定方法、细胞膜分析法、次级代谢产物分析法和传统培养法等。并综合比较各种方法的优势和不足,对石质文物的生物保护提出展望。石质文物微生物的无损或微损快速检测技术的建立,对于进一步清理石质文物的微生物污染,有效防治微生物对石质文物的腐蚀,保护我国宝贵的文化遗产具有重要的意义。     

人类致病菌新型隐球酵母Snf1/AMPK 蛋白激酶调节细胞壁的完整性

摘要：【目的】Snf1/AMPK在真核生物中是重要的且高度保守的一类蛋白激酶。在新型隐球酵母中,SNF1 基因在调节致病因子的生物合成和细胞毒力方面具有重要作用。本文进一步报道了该基因在维持细胞壁完整方面的新功能,这一功能在其他微生物中未见报道。【方法】利用荧光增白剂染料（Calcofluor white dye）染色,荧光显微观察细胞分离、胞壁完整性;利用恒定流速和压力水流冲击菌落,测定细胞黏附琼脂糖表面能力;在含有十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）,刚果红（Congo red）染料和增白剂（Fluorescent Brightener 28）的培养基上观察突变株的生长情况,以验证细胞壁完整性。【结果】SNF1 基因突变菌株对细胞壁抑制剂SDS等敏感,表明细胞壁完整性的损坏;在葡萄糖固体培养基上表现为细胞与琼脂间的黏附力丧失;在热击压力下,该菌株不能正常生长,而这种生长缺陷能够被渗透平衡抑制。【结论】新型隐球酵母SNF1 基因对于维持细胞壁完整性是非常重要的,并且影响细胞与琼脂间黏附作用以及细胞对抗热的能力。     

球毛壳菌降解天然木质纤维素能力差异及酶系基因分析简

目的：以不同植物中分离到的4株内生球毛壳菌NK102、NK103、NK104和NK105为对象,研究不同生态来源球毛壳菌降解木质素和纤维素的能力。方法：首先采用羧甲基纤维素和纤维素刚果红平板检测各菌株的纤维素降解能力,并利用Bavendamm平板反应检测各菌株的木质素降解能力;将4株菌分别培养在以微晶纤维素、杨树叶和木屑为惟一碳源的液体培养基中,通过检测培养液中纤维素酶和漆酶的酶活力,比较各菌株分解利用天然木质纤维素材料的能力,连续培养12d后检测培养液中次级代谢产物的合成情况;利用已测序的球毛壳菌CBS148．51的基因组信息,寻找编码木质纤维素降解酶类的基因,为球毛壳菌分解利用木质纤维素提供分子生物学依据。结果：NK102、NK103、NK104和NK105在羧甲基纤维素培养基和纤维素刚果红培养基上都能够生长并形成水解圈;Bavendamm平板反应显示4株菌降解木质素的能力由强到弱依次是NK103、NK102、NK105和NK104。4株菌都能分解利用微晶纤维素、杨树叶和木屑,分泌纤维素酶和漆酶,其中NK102在以木屑为碳源的培养基上纤维素酶活力最强,达到0．76U/mL发酵液,NK103在以杨树叶为碳源的培养基上漆酶活力最强。与此同时,4株菌在发酵培养过程中都能够稳定地合成球毛壳甲素（ChA）,ChA产量受到碳源影响,在以杨树叶为碳源的培养基上,NK104的ChA产量最高,可达到14．88mg/L发酵液。利用已测序的球毛壳菌CBS148．51的基因组信息,寻找到119个编码纤维素半纤维素酶的基因、8个编码漆酶的基因和2个编码锰过氧化物酶的基因,球毛壳菌具有完整的降解纤维素半纤维素的酶体系,在木质纤维素降解真菌的开发过程中具有重要的研究价值。结论：本研究为球毛壳菌木质纤维素降解过程的研究及该菌种的开发利用奠定了基础。     

微生物生理学课程建设与教学改革体会

在一流本科人才培养中,打造一流"金课"要求严格围绕"两性一度"的标准,即"高阶性、创新性和挑战度"进行课程建设。南开大学国家级微生物学教学团队在"微生物生理学"课程已有的基础上,重新精心编排了教学内容,制作了微生物生理学在线课程。课程组利用在线课程开展了翻转课堂及线上线下的混合式教学,在课程内容上增加了难度,学生课上课下需要较多的时间进行学习和思考;课程内容上增加了前沿性和时代性;教学形式上则通过IT辅助教学工具等充分体现了教学方式的先进性和互动性;教学中严格把控课堂教学管理的各个环节,利用雨课堂、蓝墨、智慧树等新技术新手段进行辅助教学,包括考勤、课堂激活、课堂随堂测验、有效测评和总结等教学活动;通过开展互动式、探究式教学,组织学生进行高质量的课堂讨论,培养学生主动学习、主动思考和主动表达的能力;采用多元化的作业设计体系和课程考核方式,加大对学生学习的全过程考核,培养学生独立思考、学以致用的能力。该课程已成功在"中国大学慕课"平台上线。通过微生物生理学在线课程的建设和运用,成功地将此课程从"知识传授型"课程转变为"能力培养型"课程。     

条件致病真菌新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans）致病性研究进展

摘要：真菌感染引起的疾病在临床上呈现较快的上升趋势,在国际上引起了广泛的重视。新型隐球酵母是主要病原真菌之一。过去十余年,对其致病的分子生物学研究有了较大的进展。重要致病因子（virulence factors）的合成调控及致病过程中信号传导途径等研究进展较快,这些都可能成为治疗甚至预防该真菌的焦点。本文在简要介绍致病因子的基础上,详细综述了分子生物学研究的进展情况。