基于SecA基因的鰤鱼诺卡氏菌qPCR检测方法的建立及进化分析

为对诺卡氏菌病进行快速早期诊断,建立了鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)TaqMan qPCR检测方法。以鰤鱼诺卡氏菌的管家基因SecA为靶标设计引物和探针,对反应条件进行优化,制作标准曲线,进行灵敏性、重复性和特异性测试,并将建立的方法应用于临床样品的检测。结果表明,优化后,引物和探针终浓度分别为0.3和0.1μmol/L,退火延伸温度60℃时,qPCR在9.85×10¹⁰—9.85×10⁰ copies内呈良好的线性关系,灵敏度最高达9.85 copies;重复性实验结果显示,组间和组内变异系数均小于1%;特异性结果表明,对无乳链球菌、弗氏柠檬酸杆菌和维氏气单胞菌等13种病菌均无扩增曲线;临床对42份大口黑鲈样品进行检测,结果表明,qPCR检出率比普通PCR提高14.24%;对发病大口黑鲈的组织及结节部位检测显示,结节部位菌载量大幅高于非结节部位,最高相差1000倍;SecA基因分析结果显示,SecA基因在传代中和种内高度保守,种间具有一定的离散性,是个很好的用于诺卡氏菌种鉴定的靶基因。研究建立的鰤鱼诺卡氏菌qPCR检测方...     

黄颡鱼拟态弧菌的鉴定、毒力相关因子及药敏特性

2018年浙江省黄颡鱼主养区暴发了严重的溃疡病, 为查明该病的病原特点, 了解病原的致病因子及药物敏感性, 对溃疡黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)上分离的多株优势菌, 分别采用生理生化特性和管家基因16S rRNA、pyrH的系统进化树进行分类鉴定, 通过人工回归感染试验分析菌株的病原性, 利用平板法测定相关的毒力因子并采用PCR法对毒力相关基因进行检测, 应用微量二倍稀释法测定14种抗菌药物的最小抑菌浓度。结果表明, 11株优势菌皆为拟态弧菌, 2株代表菌腹腔注射感染黄颡鱼后均可引发溃疡症状; 11株拟态弧菌均具有溶血活性、蛋白酶、明胶酶和DNA酶活性, 不具有卵磷脂酶活性, 可分泌产生铁载体; 所有菌株均携带vmh、ompU、toxR及matCDB-iucABCD-iutA等毒力相关基因, tcpA、ctxA、st、zot、ace、tdh等毒力基因均未检出。各菌株对氨苄青霉素、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺间甲氧嘧啶高度耐药, 对环丙沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、多西环素、土霉素、甲砜霉素、红霉素、交沙霉素、磺胺二甲氧嘧啶较敏感, 个别菌株对新霉素和甲砜霉素耐药。以上研究结果表明, 拟态弧菌感染可引起黄颡鱼溃疡病, 不同发病养殖场的分离株具有相同的表型特征及毒力基因型, 并具有较一致的生理生化特性和耐药谱型, 说明它们具有相同的遗传背景或传染源。     

自然微生物挂膜处理水产养殖废水的效果及微生物群落分析

以弹性填料和流化床填料为硝化反应的生物挂膜材料, 聚羟基丁酸/戊酸共聚酯(PHBV)为反硝化反应的碳源和生物膜载体, 通过微生物自然挂膜处理低C/N比水产养殖废水, 去除水体中的氨氮、亚硝酸盐氮及总氮。应用Miseq高通量测序技术对生物膜的微生物群落组成和结构进行分析。结果表明: 温度25—30℃, 该处理系统首次挂膜成功需要4周, 启动后运行稳定, 对2种不同来源和氮污染程度的养殖废水均有较好的脱氮效果, 氨氮、亚硝酸盐氮及总氮的去除率均在90%以上。硝化生物膜(a)的优势菌分别归属变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)。反硝化生物膜(b)微生物群落的多样性指数和丰度指数均远大于前者, 主要为变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体门(Spirochaetae)及绿菌门(Chlorobi)。其中, 归属于变形菌门β-变形菌纲(Betaproteobacteria)的丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)和红环菌科(Rhodocyclaceae)在2种生物膜中占比均较高。由于所处环境(载体, 碳源、溶氧等)不同, 在属分类水平上, 2种生物膜的细菌群落结构表现出明显差异。生物膜a中属的种类仅为b的三分之二, 相对丰度>0.5%的优势菌属, a为8个, b为18个。其中, 隶属丛毛单胞菌科和红环菌科未知属的优势种群分别占到a、b总序列数的56.67%和45.51%。磁螺菌属(Magnetospirillum)和硝化螺菌属(Nitrospira)是a中特有的优势功能菌群, 梭菌属(Clostridium)、动胶菌属(Zoogloea)、管道杆菌属(Cloacibacterium)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)等具有反硝化功能的菌群为b的优势菌属。     

哈维氏弧菌胞外蛋白酶基因的克隆表达及免疫原性

根据实验室分离的大黄鱼弧菌病主要病原菌哈维氏弧菌(Vib rio harveyi)GYC1108-1株的胞外蛋白酶基因序列,设计胞外蛋白酶基因(ΔProA)特异性引物,扩增获得1552bp的ΔProA基因,克隆于pUC57-T载体;将ΔProA基因亚克隆到原核表达载体pET-28a进行融合表达,SDS-PAGE电泳检测发现,ΔProA融合蛋白经IPTG诱导后在大肠杆菌中以包涵体形式表达,分子量大小约55kD,诱导5h的表达蛋白产量约占细菌总蛋白的21%。Western blot分析,表达的55kD蛋白具有较高免疫原性。用纯化的ΔProA融合蛋白对大黄鱼进行免疫试验,结果免疫保护率达到75%。       

乌鳢结节病病原-诺卡氏菌的分离与鉴定

乌鳢(Ophiocealus argus)又称黑鱼、乌鱼、才鱼,隶属于硬骨鱼、鲈形目、攀鲈亚目、鳢科、鳢属,我国分布于除新疆、西藏外的各大水系,为凶猛的肉食性鱼类,营养、药用和经济价值较高,具有生长快、疾病少、适应性强、产量高等特点,价格稳定,深受养殖户喜爱,已成为淡水名特优养殖的主导品种之一.     

嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的分子机制

摘要:【目的】调查从浙、苏、皖等地水产动物中分离的23 株致病性嗜水气单胞菌的耐药谱并探索喹诺酮类抗生素耐药菌株的耐药分子机制。【方法】根据美国临床实验室标准化协会药敏判断标准(2011 版)测定23株嗜水气单胞菌耐药谱并筛选喹诺酮类抗生素耐药株;对筛选的耐药菌株和体外诱导耐药菌株的gyrA和parC基因耐药决定区进行分析;用二倍稀释法测定加入多重耐药外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙前后耐药菌株对恩诺沙星最小抑菌浓度的变化,同时检测喹诺酮类药物相关的外排泵基因qepA、oqxA和mdfA;并检测质粒介导的喹诺酮耐药的qnr家族基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD和qnrS。【结果】所有菌株都存在对5种以上药物的耐药性;39.1%(9/23)的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药,其中55.6%(5/9)对恩诺沙星耐药。耐恩诺沙星的5株菌株均携带qnrS,而不携带qnrA、qnrB、qnrC、qnrD基因,也不携带外排泵基因qepA、oqxA和mdfA。其中耐药菌株AH19同时存在gyrA与parC基因双突变、质粒介导的耐药基因qnrS和主动外排泵三种耐药机制,菌株AH4、AH7和AH20存在gyrA与parC基因双突变和质粒介导的耐药基因qnrS两种耐药机制,AH6存在gyrA基因突变和质粒介导的耐药基因qnrS机制,体外诱导耐药菌株ATCC7966-QR相对于原始菌株ATCC7966发生了gyrA与parC基因双突变。【结论】喹诺酮类药物作用靶位的改变和质粒介导的耐药基因qnrS的存在是本研究中涉及的嗜水气单胞菌对喹诺酮类药物耐药的主要作用机制,主动外排泵机制是个别菌株存在的耐药机制。