杀鱼假交替单胞菌C923几丁质酶基因PpchiC的克隆表达与酶学性质

【背景】某些假交替单胞菌可分泌几丁质酶,在降解利用几丁质为水产动物提供营养、免疫、抗病等方面有着重要潜力。【目的】克隆杀鱼假交替单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)C923的一个几丁质酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并对重组几丁质酶的酶学性质进行研究。【方法】从菌株C923测序的基因组中注释到一个几丁质酶家族基因PpchiC,设计引物克隆该基因后进行生物信息学分析;构建载体进行异源表达并从温度、时间与诱导剂浓度进行表达优化;对表达蛋白进行最适温度与pH等酶学性质研究,同时比较了重组菌破碎后上清与沉淀及纯化的酶蛋白对几丁质的降解效应。【结果】基因PpchiC长1350bp,编码450个氨基酸,PpchiC蛋白理论分子量为48.76kDa,等电点为4.78,不稳定系数为29.08。结构域分析发现该蛋白含有一个类型Ⅲ几丁质结合域和一个糖苷水解酶18家族(glycosyl hydrolase 18,GH18)的催化域;PpchiC蛋白含有GH18家族几丁质酶的保守催化基序DxxDxDxE、YxR和[E/D]xx[V/I]。16℃、0.25mmol/L IPTG、诱导12h为其最优化表达条件,PpchiC在50℃、pH8.0时表现出最大酶活性;以胶体几丁质为底物时,PpchiC的K_m值为2.58mg/mL、V_max值为5.04mg/(mL·min)。降解结果表明,菌体的沉淀与上清及从上清中纯化的酶蛋白均有着较好的几丁质降解效应。【结论】杀鱼假交替单胞菌C923基因PpchiC编码GH18家族的几丁质酶,能被大肠杆菌高效表达且降解几丁质效应明显,这为PpchiC及菌株C923的应用提供了参考依据。     

一株吡啶降解菌Pseudomonas sp.ZX08的生物膜形成特性及影响因素

【背景】煤化工企业排放的废水中含有大量难降解、高毒性的有机污染物,采用以高效降解菌为基础的生物强化技术对其进行处理,是一种经济可行的策略;而促进高效降解菌在载体材料表面的生物膜形成,有助于提升生物膜法废水处理系统的效能。【目的】探究一株吡啶高效降解菌Pseudomonas sp. ZX08的生物膜形成过程和特性,识别不同的环境因子如温度、pH、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等对其生物膜形成的影响规律,为实现人工调控其在实际废水处理系统中的成膜过程提供理论依据。【方法】采用改良的微孔板生物膜培养与定量方法,以单因子影响实验测定不同条件下菌株在12孔板内的生物膜形成量和浮游态细菌量;采用激光共聚焦显微镜(confocallaserscanning microscope,CLSM)观察和分析生物膜的结构特征。【结果】Pseudomonas sp. ZX08菌株具有良好的吡啶降解性能,且生物膜形成能力较强,CLSM观察到其在载体表面形成的生物膜可达40-50mm;生物膜外层的活细胞比例更高,分泌的胞外蛋白...     

光周期对许氏平鲉性腺分化过程中形态学、性激素水平及相关基因表达的影响

研究以35日龄(dpb)许氏平鲉(Sebastes schlegelii)仔稚鱼为对象,研究不同光周期(短光照组L﹕D=8﹕16、长光照组L﹕D=16﹕8和对照组L﹕D=12﹕12)对性别分化、相关激素水平及基因表达水平的影响。结果显示非自然的光周期尤其是较短的光照,会不同程度地影响性腺分化时期性腺发育程度,并且短光照会导致部分性腺雄性化;雌激素(E2)在短光照组中更早出现峰值,而雄激素(T)在3个处理组中均在实验第9天时达到峰值; 4个卵巢分化相关基因cyp19a1a、ERα、ERβ2和foxl2中, ERα、ERβ2和foxl2受短光照影响显著,实验中后期出现明显的抑制(P<0.05); 4个精巢发育相关基因sox3、sox9、amh和dmrt1相对表达水平未见明显规律,可能与精巢分化时间较晚有关。综合而言,较短的光照会影响性腺的发育以及性腺的分化,抑制卵巢分化基因的表达,诱导原始性腺雄性化。     

东北黑土区片蚀和沟蚀对土壤团聚体流失的影响

土壤侵蚀方式的差异必然会导致土壤团聚体破碎程度及流失过程的不同。基于室内模拟降雨试验,对比研究了黑土坡耕地片蚀和沟蚀对土壤团聚体流失的影响。结果表明,在50和100 mm/h降雨强度下,沟蚀试验处理的侵蚀量分别是片蚀试验处理的1.42倍和3.51倍左右。在片蚀试验处理下,当降雨强度由50 mm/h增加至100 mm/h时,侵蚀泥沙中微团聚体（< 0.25 mm）含量由45.7%增加至74.2%;而在沟蚀试验处理下,侵蚀泥沙中以大团聚体（≥0.25 mm）为主,其占团聚体流失量为65.5%。片蚀试验处理下,50 mm/h降雨强度时,侵蚀泥沙中 > 5和2-5 mm粒级的团聚体含量均小于沟蚀处理,而其它粒级的团聚体含量均大于沟蚀处理;在100 mm/h降雨强度下,侵蚀泥沙中团聚体各粒级的含量均小于沟蚀处理。与试验土壤相比,表征团聚体流失的两个特征指标平均重量直径（MWD）和几何平均直径（GMD）均明显减少;在两种降雨强度下,片蚀试验处理的MWD和GMD均明显小于沟蚀处理。研究还发现MWD和GMD两种团聚体指标均能反映黑土农耕地坡面片蚀和沟蚀方式下的团聚体流失特征,且MWD能够更好的反映出雨强变化时两种侵蚀方式下土壤团聚体的流失特征。     

芜湖市镜湖轮虫群落结构分析及水质的生态学评价

2003年1—12月,对芜湖市镜湖轮虫群落结构的周年动态进行了研究,并分析了轮虫密度与有关生态因子间的关系。经鉴定,共发现轮虫55种,隶属于15科21属。密度优势种为裂痕龟纹轮虫(Anuraeopsis fissa)、暗小异尾轮虫(Trichocerca pusilla)、前额犀轮虫(Rhinoglena frontalis)、红多肢轮虫(Polyarthra remata)、长三肢轮虫(Filinia longise-ta)、广布多肢轮虫(Polyarthra vulgaris)和多须伪前翼轮虫(Proalides tentaculates),而生物量优势种为前节晶囊轮虫(Asplanchna priodonta)、多须伪前翼轮虫和暗小异尾轮虫。全年轮虫的总密度与水温、叶绿素a浓度及小型纤毛虫密度具有显著的相关性;温度对全年轮虫总密度的影响最大,叶绿素a浓度对春、冬季轮虫总密度影响最大,小型纤毛虫密度对夏季轮虫总密度影响最大,而水温是影响秋季轮虫总密度的主要因素。根据污染指示生物、物种多样性指数和Q值并结合水理化性质对治理后的镜湖水质所进行的初步评价表明,经清淤、截流和换水等措施治理后,小湖区应偏属寡污-β中污至β中污型水体,大湖区属于β中污型水体;目前镜湖水体处于中营养后期—富营养化初期阶段。       

非洲猪瘟病毒CP204L基因的原核表达与单抗制备

由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的非洲猪瘟(ASF)给我国养猪业带来了不可估量的经济损失,严重阻碍了我国养猪业的发展,研发ASFV快速诊断试剂是目前最重要的内容之一。CP204L基因编码ASFV结构蛋白p30。本研究以克隆ASFV的CP204L基因为基础,通过基因重组技术,加入His标签,将构建的重组质粒命名为pET-28a-CP204L。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,37℃经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达6h,表达蛋白进行SDS-PAGE鉴定和Western Blot检测。重组蛋白纯化后免疫小鼠制备筛选单克隆抗体,Western Blot和IFA验证单抗的结合特异性。结果表明,重组的pET-28a-CP204L诱导后表达蛋白为30kD,以不可溶性包涵体形式存在;表达蛋白利用His标签进行纯化,获得纯化蛋白2mg,单克隆抗体筛选获得5株IgG亚型的ASFV p30蛋白的单抗,且均具有良好的结合活性。本研究为发展ASFV检测方法提供了基础。     

毕赤酵母表达的嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶N-糖基化修饰的作用与功能

【目的】研究N-糖基化对来源于嗜热蓝状菌β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,Bgl3A)的酶学性质影响。【方法】采用定点突变技术构建了3个去N-糖基化的突变体T44A、S228A、S299A,并分别在毕赤酵母GS115中表达纯化。【结果】与野生型Bgl3A相比,突变体S228A分泌蛋白产量极低,仅能微量检测到p NPG活性;突变体T44A和S299A的最适pH和最适温度没有改变,分别为4.0和75°C,但二者的T_m值和70°C下的热稳定性都明显优于野生型。以p NPG为底物时,突变体S299A和T44A的催化效率分别降低了14.5%和70.0%;以纤维二糖为底物时,T44A的催化效率基本不变,而S299A的催化效率提高了1.1倍。【结论】Bgl3A不同位点的N-糖基化修饰对酶的分泌和酶学性质的影响具有明显差异。其中,N226位的N-糖基化在维持酶的表达和功能方面至关重要,而去除N297位点的N-糖基化可以提高酶的热稳定性及对纤维二糖的催化效率。     

基于酶热稳定性系统计算的乳酸氧化酶热稳定性改造

乳酸氧化酶能够催化乳酸氧化为丙酮酸,具有重要的工业应用价值,但已有研究表明,不同来源的乳酸氧化酶均存在热稳定性不好的问题,影响了其在工业当中的应用。目前对于乳酸氧化酶的研究报道较少,对其热稳定性的改造更未见报道,因此提高乳酸氧化酶的热稳定性具有重要意义。克隆表达了一个高比活乳酸氧化酶(Eg LOD),通过生物信息学辅助分析及表面电荷分析软件(ETSS)对乳酸氧化酶的蛋白结构进行理性分析,基于蛋白表面电荷分布优化设计了9个突变体尝试对其进行热稳定性改良。通过对突变体的筛选获得了两个有效提升热稳定性的突变体D250N,D281N,在60℃下处理30 min仍然能够保持50%以上的酶活,而野生型Eg LOD酶活仅剩20%左右。     

四个类群海洋蛭弧菌类生物生长特性的比较

研究了噬菌弧菌科(Bacteriovoracaceae) 4个类群共12株海洋蛭弧菌类生物(Bdellovibrio- and-like organisms, BALOs)的生长温度和盐度范围及其对6种常见对虾病原弧菌的裂解能力, 并通过透射电镜分析了其中4个代表菌株的形态特征。结果表明, 同一群或亚群内菌株的生长温度或盐度相同, 即类群IV、VI、IX、X菌株的生长温度范围分别为20°C~35°C、15°C~35°C、15°C~ 40°C和10°C~40°C, 最适生长温度为30°C或35°C; 生长盐度范围分别为5‰~40‰、2.5‰~30‰、5‰~60‰和5‰~60‰, 最适生长盐度分别为10‰、5‰、20‰和20‰。测试的6种弧菌中有3种可被全部BALOs裂解, 而其它弧菌仅被部分BALOs裂解, 但即使同一类群菌株, 对某些弧菌也表现不同的裂解能力。形态上, 4株不同类群BALOs均呈典型的弧状细胞, 具极生单鞭毛。     

湖泊富营养化对轮虫群落结构及物种多样性的影响

2005年7月至2006年6月, 我们对安徽省芜湖市境内5个湖泊中轮虫的群落结构及部分水质特征参数进行了调查, 用相关加权综合营养状态指数(TLIc)评价了各湖泊的营养水平, 分析了其中的轮虫群落结构、多样性指数及其与TLI_C之间的关系。经鉴定, 5个湖泊中共采集到轮虫79种, 隶属18科31属; 不同营养水平湖泊中出现的轮虫种类数有明显的差异(P<0.01)。除龙窝湖外, 其余4个湖泊中的轮虫种类数与TLI_C均呈显著负相关关系(r＝–0.984, P<0.05)。湖泊水体的富营养化进程显著地提高了轮虫总密度和第一优势种的优势度, 降低了轮虫群落的均匀度和物种多样性指数。