云南蝙蝠轮状病毒的分离与鉴定

蝙蝠是携带人兽共患病毒最多的一种哺乳动物,调查蝙蝠携带病毒的病原生态学本底对防范蝙蝠病毒威胁人类健康具有重要意义。本研究采集云南省部分地区蝙蝠进行病毒宏基因组学分析,在一组食虫蝙蝠样品中发现了A群轮状病毒(Group A rotaviruses,RVA)序列,经过进一步RT-PCR筛查验证及病毒的分离鉴定,最终从勐远县的1只三叶蹄蝠中分离出一株轮状病毒。扩增该毒株的VP7与VP4基因进行分型与系统进化分析,结果表明其VP7基因为G3型,与来自阿根廷的1株马轮状病毒的同源性最高,为93%;其VP4基因为P[10]型,与来自泰国的1株人轮状病毒同源性最高,为94.8%。通过与本实验室之前分离的首株蝙蝠G3P[3]型轮状病毒MSLH14的比较,确定该毒株为一株新的蝙蝠轮状病毒,命名为RVA/Bat-tc/MYAS33/2013/G3P[10],简称MYAS33。本研究结果进一步证明了蝙蝠轮状病毒的多样性,突显了蝙蝠作为轮状病毒潜在宿主的重要性。     

尼帕病毒融合蛋白、受体结合蛋白的表达及特异性高免血清制备

尼帕病毒膜融合蛋白F和受体结合蛋白G在病毒感染和诱导机体产生保护性免疫中起重要的作用。通过PCR扩增获得尼帕病毒F1和G基因片段(均去掉信号肽和跨膜区),克隆至原核表达载体,IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白,Western blot表明重组F1、G蛋白与兔抗尼帕病毒血清具有良好的反应原性;同时将F1和G基因克隆至经改造过的杆状病毒表达载体,获得了含有目的基因的重组杆状病毒,接种sf9单层细胞,间接免疫荧光检测表明F1、G蛋白在杆状病毒中正确表达,并与抗尼帕病毒血清具有良好的反应原性。以纯化原核表达的F1、G蛋白免疫兔获得了抗F1和抗G重组蛋白的特异血清,Western blot和间接免疫荧光检测表明所制备的血清具有特异性。试验所表达的抗原和制备的特异血清可用于尼帕病的诊断。     

CCCTC结合因子在HeLa细胞中调控X染色体连锁的凋亡抑制蛋白的表达

目的:确定HeLa细胞的CCCTC结合因子(CTCF)表达水平是否与细胞的抗凋亡能力相关,并研究其具体分子机制。方法:用顺铂和阿糖胞苷分别诱导HeLa细胞和CTCF敲降的HeLa-CTCF-II-11细胞凋亡,比较两者的凋亡率;用基因表达芯片检测CTCF敲降后HeLa细胞的表达谱变化,寻找并验证受CTCF调控的与凋亡相关的蛋白。结果:用顺铂和阿糖胞苷诱导后,HeLa-CTCF-II-11细胞的凋亡率显著高于HeLa细胞;HeLa细胞的CTCF敲降后,X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(XIAP)的表达显著下降。结论:CTCF敲降使HeLa细胞的抗凋亡能力下降,CTCF对XIAP基因的表达调控在这个过程中起了重要作用。     

茎环法RT-qPCR定量检测细胞抗猪瘟病毒siRNA的表达

RNAi(RNA interference)已成为特异抗病毒治疗研究的热点,但siRNA(small interfering RNA)的定量检测仍是评价RNAi抗病毒效果的瓶颈。为了检测抗CSFV特异siRNA分子(siN1和siN2)在细胞中的表达水平,设计并以交叉组合方法筛选了具有较高特异性和灵敏度的siRNA特异茎环引物(SLP-N1-6和SLP-N2-8),成功地建立了最优的siN1和siN2的茎环法RT-qPCR检测方法。该方法表现出良好的特异性和较高的灵敏度,能检测出102至108个拷贝的siRNA,至少可达7个数量级的检测范围,平行性好(Rsq=0.999),扩增效率高(Eff.=98.2%)。茎环法RT-qPCR能准确地定量检测抗CSFV的PK-15细胞克隆的siN1/siN2表达水平,可结合常规的检测病毒水平的间接免疫荧光和TCID50等技术定量评价RNAi抗CSFV的有效性,为未来抗猪瘟转基因猪的抗病毒效果评价提供了先进的检测技术。     

狂犬病病毒SRV9疫苗株糖蛋白核酸序列及抗原特性研究

狂犬病病毒SRV9株是经克隆获得的中等蚀斑口服弱毒疫苗候选株,具有安全和免疫原性较好等优点.本试验根据狂犬病病毒糖蛋白核苷酸5'末端和3'末端序列设计了一对引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分别扩增了SRV9及其母源株SAD B19糖蛋白的全长cDNA.测序结果表明,SRV9和SAD B19糖蛋白cDNA读框长1575bp,编码524氨基酸残基的多肽.通过和其母源株SAD B19核苷酸序列比较发现,SRV9的158、575、931位碱基分别出现了G→A、A→G和A→G的转换,相应地导致第53位、192位、311位氨基酸出现了Gly→Glu、His→Arg、Thr→Ala突变;和我国现行的犬用疫苗株ERA的核苷酸和氨基酸比较,有10个碱基不同,7个氨基酸发生改变.经Jameson-Wolf抗原表位优势图分析发现,SRV9在192位氨基酸的改变,导致该部位产生了一个新的潜在抗原位点.由于狂犬病病毒糖蛋白是诱导机体产生中和抗体唯一抗原,因此,上述氨基酸的改变可能与其特殊的蚀斑特性和其安全性提高有关.保持对毒株的氨基酸序列分析也是监测其特性的重要手段之一.     

桂越边境地区蝙蝠病毒组研究

桂越地区包括越南和我国广西,地理位置的战略意义突出,该地区蝙蝠资源丰富,且越南境内的蝙蝠携带多种人兽共患病毒.为了监测桂越边境地区蝙蝠病毒的跨境传播,防范蝙蝠病毒引发新发传染病,掌握该地区蝙蝠携带病毒的病原本底和重要病毒遗传进化特征具有重要意义.本研究在桂越边境采集蝙蝠样本并对其进行病毒宏基因组学分析,结果发现了49个科的病毒,包括脊椎动物病毒、植物病毒、昆虫病毒和噬菌体.根据病毒宏基因组学结果,对注释到的嗜肝DNA病毒、博卡细小病毒、A型轮状病毒、星状病毒、弹状病毒和冠状病毒进行检测和进化分析,结果发现星状病毒广泛分布,且具有丰富的遗传多样性;其他病毒则呈局部分布,其中嗜肝DNA病毒、冠状病毒、轮状病毒与各自参考毒株进化关系较近,为这些病毒的变异毒株;而博卡细小病毒和弹状病毒与已知病毒具有很明显的遗传差异性,可能为病毒新种;值得注意的是,发现的蝙蝠轮状病毒与广西当地人轮状病毒具有很高的同源性,提示该病毒的跨种传播和基因重排.本研究获得了桂越边境地区蝙蝠携带病毒的本底数据以及部分重要病毒在该地区蝙蝠中的流行情况和遗传进化特征,为监测蝙蝠病毒的跨境传播、防范新发病毒病提供了重要的基础数据.     

云南蚊虫中阿卡斑病毒的分离和鉴定

为掌握云南省德宏州芒市和瑞丽市蚊媒病毒分布状况,2010年8月用诱蚊灯采集蚊虫17种2 149只,用金黄地鼠肾细胞(Baby hamster kidney cell,BHK-21)培养法分离病毒,阳性分离物用阿卡斑病毒(Akabane virus,AKV)S和M片段特异性引物的RT-PCR法鉴定。从采集蚊虫中分离到能引起BHK-21细胞病变和致乳小白鼠发病死亡的2株病毒,其中DHL10M110株分离自瑞丽市迷糊按蚊(Anopheles vagas),DHL10M117株分离自芒市三带喙库蚊(Culex tritaeniorhynchus)。RT-PCR扩增获得S片段的702bp序列和M片段的456bp序列,系统进化树分析表明DHL10M110和DHL10M117株与肯尼亚和澳大利亚AKV分离株进化关系较远;与日本、韩国和中国台湾的AKV分离株亲缘关系较近,但云南株形成一个独立的小分支。2株新分离病毒的S片段与中国台湾CY-77株的核苷酸(96.6%和96.7%)和氨基酸(99.6%和100%)同源性最高;M片段与日本Iriki株的核苷酸同源性最高(93.2%和93.6%),与中国台湾CY-77株氨基酸同源性最高(99.6%和100%);与肯尼亚MP496株核苷酸(69.7%和70.0%)和氨基酸(91.0%)同源性最低。本研究证实云南省德宏州存在AKV的流行,与亚洲流行株具有较近的亲缘关系。三带喙库蚊和迷糊按蚊可传播该病毒。     

多联PCR诊断技术的建立及其对多种动物病毒的检测

多联PCR是指用多对引物在同一反应体系中对多个目的基因片段同时进行扩增,它能够捕获较多的核酸信息,完成较为复杂的核酸分析。与单项PCR相比,具有省时、省力、降低成本及减少污染等优点。目前,该项技术已在遗传疾病诊断、病原分析、连锁分析及法医学研究等方面逐步得到应用。 病毒性猪繁殖障碍是危害我国养猪业的一类重要传染病,主要是由狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和日本乙型脑炎病毒(JEV)等