Lys_(10)-PAI-1融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和凝胶阻滞实验

用PCR方法构建 10个赖氨酸与纤溶酶原激活剂抑制物 1的融合基因Lys10 PAI 1,并克隆于pET2 8a(+ )和pET32a(+ )原核表达载体 .将重组表达质粒pET32 PAI和pET2 8 PAI转化大肠杆菌BL2 1(DE3) .IPTG诱导后可获得分子量分别为 6 3kD和 4 3kD的目的蛋白 ,表达蛋白占菌体蛋白2 0 %以上 ,大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物经变性、复性、超滤、透析和亲和层析等步骤 ,可以得到纯化的Trx·PAI 1和rPAI 1重组蛋白 .Western印迹结果表明 ,目的蛋白具有人PAI 1的抗原性 .凝胶阻滞实验发现 ,纯化的重组蛋白在一定条件下 ,可以与质粒结合 ,使质粒的迁移率明显改变 .研究结果表明 ,Trx·PAI 1和rPAI 1有希望成为受体介导基因转移的配体     

蛋白酶抑制剂1O—Ov-抑丝酶家族的新成员

抑丝酶(serine proteinase inhibitor,ser-pin)是一类与α1-蛋白酶抑制剂(α1-PI)结构相类似的蛋白质组成的超家族,在一系列重要的生理病理过程中,如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等,发挥着重要作用。其中,鸡卵清蛋白亚家族又代表了一系列结构更为相似的抑丝酶蛋白,纤溶酶原激活剂抑制剂2(PAI-2)、人白细胞弹性蛋白酶抑制剂(human leukocyte elastase inhibitor,HLEI)、胞浆抗蛋白酶(CAP)、蛋白酶抑制剂6(PI-6)、蛋白酶抑制剂9(PI-9)等都是该家族的典型成员。1995年人们又从人骨髓细胞eDNA文库中克隆出了一个新基因Bomapin(bonemarrow associated serpin),该基因编码一个分子量为45 kD的蛋白质,被基因组数据库委员会命名为蛋白酶抑制剂10(PI-1O)[1],同源性分析表明它是Ov-抑丝酶家族的新成员。     

蛋白酶抑制剂10——Ov-抑丝酶家族的新成员

抑丝酶 (ｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,ｓｅｒ ｐｉｎ)是一类与α1 蛋白酶抑制剂 (α1 ＰＩ)结构相类似的蛋白质组成的超家族 ,在一系列重要的生理病理过程中 ,如凝血、纤溶、补体活化、感染、细胞迁移等 ,发挥着重要作用。其中 ,鸡卵清蛋白亚家族又代表了一系列结构更为相似的抑丝酶蛋白 ,纤溶酶原激活剂抑制剂 2 (ＰＡＩ 2 )、人白细胞弹性蛋白酶抑制剂(ｈｕｍａｎｌｅｕｋｏｃｙｔｅｅｌａｓｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ,ＨＬＥＩ)、胞浆抗蛋白酶 (ＣＡＰ)、蛋白酶抑制剂 6 (ＰＩ 6 )、蛋白酶抑制剂 9(ＰＩ 9)等都…     

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1的结构与功能

T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T-lymphoma invasion and metastasis inducing factor 1，Tiam1)是Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-Related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)的特异性鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide ex-change factor，GEF)。在细胞外信号刺激下Tiam1可以促进Rac1从无活性的GDP结合状态向有活性的GTP结合状态转换，有活性的Rac1-GTP与不同的下游效应分子相互作用，从而影响多种细胞事件。     

大鼠丙酮酸激酶同工酶催化性质的比较研究

利用DEAE 纤维素柱层析分离大鼠组织匀浆105,000g 上清中的丙酮酸激酶(PyK)同工酶,发现肝和肾中存在L 及K 两型PyK,肝中以L 型为主,而肾中以K 型较多,L:K 的平均活性比值分别为6.07及0.248。但骨胳肌中只有M 型。用聚丙烯酰胺凝胶板电泳也可获得相似的同工酶谱。用硫酸铵沉淀结合层析又从大鼠红细胞中提取了R 型PyK,与上述三型一起,进行了催化性质的比较研究。结果如下:1.K 型对热极不稳定,而M 型对热最为稳定。2.L 型和K 型可利用GIP 代替ADP 作为底物,但GDP 作为底物时的酶活性远小于ADP 作底物时的活性。M 型利用GDP 的能力很小,而R 型几乎可忽略不计。3.某些氨基酸可抑制PyK,K 型PyK 对氨基酸的抑制最为敏感,可使其抑制的氮基酸最多,而M 型最不敏感,在测定的12种氨基酸中仅受苯丙氨酸抑制,L 型与R 型介于上述两型之间,可使它们抑制的氨基酸种类相似。4.氨基酸对PyK 的抑制作用与它们代谢途径中成糖或成酮的关系尚不明确,而与其结构有密切关系。能抑制PyK 的氨基酸主要是非极性氨基酸,如丙、正丁、脯、苯丙氨酸等,当这四种氨基酸的侧链羟化成相应的丝氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸或酪氨酸后,其抑制作用明显减弱或消失。5.小侧链的脂肪族氨基酸(如半胱、丙、正丁)对L 型PyK 的抑制作用强于大侧链的芳香族氨基酸(苯丙、酪);但对K 型PyK 的抑制却弱于大侧链芳香族氮基酸。并且L 型对小侧链氨基酸的敏感性大于K 型,而对大侧链氨基酸的敏感小于K 型。6.丙氨酸对L、R、K 三型PyK 的抑制作用与其α-氨基和直链结构有密切关系,其中α-氨基尤为重要。7.果糖-1,6-二磷酸(FDP)能激潘R 及K 型PyK,当底物PEP 处于低浓度时,尚可激活L 型。FDP 还能逆转各种氨基酸对四型PyK 同工酶的抑制作用,其中对R 及K 型的逆转效果较大。FDP 对各种氮基酸抑制的逆转效应并不相同。8.丝氨酸可显著激活K 型PyK,也可逆转氨基酸对K 型PyK 的抑制作用,其逆转效率仍因氪基酸而异,但其激活作用与FDP 不能相加。对上述结果作了讨论,认力这些PyK 同工酶催化性质的差异可有助于鉴定未知样品中的同工酶类型。还提出一个PyK 同工酶上有两类氨基酸结合点的假说。     

人纤溶酶原激活剂抑制物2型(PAI-2)在大肠杆菌中的表达和分离纯化

用ＰＣＲ方法从ｐＰＡＩＪ．７中扩增人纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）ｃＤＮＡ,与ｐＵＣ１８重组,经限制性内切酶片段分析与核苷酸序列分析,获得全长人ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ．ＰＡＩ－２ｃＤＮＡ与原核表达载体重组,构建原核表达质粒并转化大肠杆菌．经温度诱导表达,重组ＰＡＩ－２占全菌总蛋白的１４％,以可溶性形式存在,具纤溶抑制活性．工程菌发酵、压榨后,用硫酸铵分级沉淀,沉淀物经分子筛、离子交换和疏水性色谱的分离,每升菌液可获得约３０ｍｇ纯度达９０％的蛋白质,比活性为１１８６６ＡＩＵ／ｍｇ蛋白质,得率为１９．２％．     

ATF-PAI2CD融合蛋白基因在毕赤酵母中克隆、表达和鉴定

为了克隆尿激酶型纤溶酶原激活物 (uPA)的氨基末端片段与纤溶酶原激活剂抑制物 2型(PAI 2 )突变体所构成的融合蛋白基因 ,并在Pichiapastoris中表达 ,应用PCR获得了人ATF PAI2CD融合蛋白基因cDNA(简称ATF PAI2CD) ,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K ,获得融合基因表达质粒pZWY ATF PAI2CD .该质粒转化毕赤酵母菌GS115 ,用G4 18 YPD平板筛选高拷贝转化子 ,然后用甲醇诱导表达 .工程菌用摇瓶发酵 ,表达产物ATF PAI2CD占培养液中总蛋白 5 0 %以上 .经硫酸铵沉淀、分子筛和离子交换层析纯化得到的目标表达产物纯度达 95 % .Western印迹检测具有PAI 2与uPA的免疫原性 ,经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 .经流式细胞仪 (FCM )检测 ,能与肿瘤细胞特异性结合 .结果表明 ,ATF PAI2CD融合蛋白成功地在毕赤酵母中表达 ,且具有抑制uPA及与肿瘤细胞表面uPAR特异性结合的双重功能 .提示该融合蛋白可能具有良好的应用前景 .     

ATF-PAI2CD融合蛋白的生物学功能

为了解尿激酶型纤溶酶激活物 (urokinase typeplaminogenactivator,uPA)的氨基末端片段 (amino terminalfrag ment,ATF)和纤溶酶激活物抑制剂 2 (plasminogenactivatorinhibitortype 2 ,PAI 2 )突变体PAI 2CD融合蛋白在大肠杆菌的表达情况及进一步研究其生物学活性、将ATF PAI2CD融合基因与大肠杆菌表达载体pLY 4重组得到表达质粒pZWE ATF PAI2CD ,以其转化大肠杆菌JF112 5 ,经温度诱导 ,ATF PAI2CD获得较高水平表达 ,融合蛋白质以包涵体形式存在 ,占菌体总蛋白质的 15 %。包涵体经洗涤、8mol L尿素溶解、稀释复性及离子交换色谱一步分离 ,纯度达 90 % ,分子量与理论值相符。每升发酵液得重组融合蛋白质 5 0mg。经牛奶板法检测具有纤溶抑制活性 ,比活性达 12 0 0 0IU mg ;应用放射竞争法证实融合蛋白质能与肿瘤细胞表面的uPA受体特异性结合。双功能融合蛋白质的纤溶抑制活性与野生型PAI 2 (或PAI 2突变体 ,PAI 2CD)基本一致 ,与肿瘤细胞表面的uPA受体的结合能力同pro uPA。     

组织型转谷氨酰胺酶的研究进展

组织型转谷氨酰胺酶（tissue transglutaminase,tTG,TGⅡ）是转谷氨酰胺酶家族成员之一,作为一种多功能的蛋白质,具有催化蛋白质谷氨酰胺残基与赖氨酸残基交联的活性,还能结合和水解GTP,在胞内和胞外产生多种功能,最初由于tTG在细胞凋亡中所起的重要作用而受到研究者的关注,最近的研究更表明它在细胞分化,基质的稳定、伤口愈合、信号转导、动物发育等许多生理和病理过程中起着重要作用,因而受到越来越多的研究。     

uPA与其抑制剂复合物的受体介导内吞及其应用

尿激酶型纤溶酶原激活物 (ｕＰＡ)是参与细胞外基质降解的重要成分 ,在肿瘤细胞的侵袭和转移中起着重要作用。人们对ｕＰＡ的结构、功能以及它与纤溶酶原激活抑制物 1 (ＰＡＩ 1 )、ｕＰＡ受体 (ｕＰＡＲ)的相互作用都进行了深入的研究。单链ｕＰＡ是一种糖蛋白 ,含有 41 1个氨基酸。其结构可分为四部分 ,依次为 :上皮生长因子区、环状结构区、连接区和丝氨酸蛋白酶区。纤溶酶可裂解Ｌｙｓ1 5 8 Ｉｌｅ1 5 9之间的肽键 ,使单链ｕＰＡ转变为双链ｕＰＡ。ｕＰＡ与其细胞表面受体结合后激活纤溶酶原 ,自身激活也增强。结合在细胞膜上的ｕＰＡ…