糖基化、非糖基化、重组PAI－1功能和性质的比较

对从ＨｅｐＧ２细胞培养液中分离得到植基化和非糖基化ＰＡＩ－１（１型纤溶酶原激活物抑制剂）,以及从ｐＹＺＨＢＩ－６６表达菌中纯化的非糖基化重组ＰＡＩ－１的某些性质和功能进行比较,结果显示,糖基化ＰＡＩ－１对ｔＰＡ（组织型纤溶酶原激活物）有较强的抑制,能较显著地被蛋白质变性剂所激活,对热有较强的稳定性,糖基化与非糖基化ＰＡＩ－１在ｐＨ２．５－９．０的范围内都相当稳定。纤维蛋白原和肝素能明显提高两者对ｔＰＡ的抑制作用。     

PAI—2及其突变体的生物化学性质

为研究和比较纤深酶原激活剂抑制物２型（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｙｐｅ ２,ＰＡＩ－２）及其突变体的生物化学性质,用ＰＣＲ、体外定点突变技术构建ＰＡＩ－２突变体ＰＡＩ－２ＣＤ和ＰＡＩ－２ＱｃＤＮＡ,将突变体ｃＤＮＡ与原核表达载体重组并转化怕杆菌。经诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证实表达出相应蛋白质,均占全菌总蛋白的１４％。Ｗｅｔｅｒｎ印迹、溶圈抑制及纤维蛋白翻转板     

抗D－双聚体单抗轻链可变区基因的克隆

以分泌小鼠抗人纤维蛋白降解产物D－双聚体单克隆抗体杂交瘤细胞株的mRNA为模板,用小鼠免疫球蛋白轻链可变区基因的通用引物,通过RT－PCR扩增基因,与载体重组后,经酶切鉴定和核苷酸序列分析,证明克隆含抗D－双聚体单抗的轻链可变区基因,长度为330 bp．     

t-PA cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用ＰＣＲ方法,在ｔ－ＰＡ ｃＤＮＡ５＇端引入合适的限制酶位点和酵母分泌信号肽,与酵母表达载体ｐＰＩＣ９重组,构建表达质粒ｐＳＴＥ－Ｙ,利用ＬｉＣｌ转化法转化酵母菌ＹＳ１０８,在ＭＭ和ＭＤ平板上筛选表型,ＰＣＲ筛选ｔ－ＰＡ ｃＤＮＡ与酵母染色体整合而形成的阳性克隆,阳性克隆经甲醇诱导表达后,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明表达产物的分子量为６ｋＤａ左右,用酪蛋白板溶圈法测定ｔ－ＰＡ的活性。Ｍｕｔ＾ｓ表型菌表     

甲醇营养型酵母表达系统的研究进展

甲醇营养型酵母越来越被人们用作外源基因的表达系统。本文综述其在表达质粒构建,表达株的筛选,表达产物的糖链加工以及它分拣外源蛋白进入过氧化物酶体等的特点,不仅具有广泛的商业用途,而且在理论研究特别是膜蛋白结构与功能方面也有潜在应用价值。     

Rac的研究进展

Ｒｈｏ家族小Ｇ蛋白 (Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ)参与细胞骨架重组、基因转录调控和细胞信号转导等生理过程 ,从而影响细胞的极性、粘附、生长和运动能力。有证据表明Ｒｈｏ家族成员还参与肿瘤细胞的侵袭和转移。Ｒａｃ是Ｒｈｏ家族小Ｇ蛋白的成员之一 ,有Ｒａｃ1、Ｒａｃ2、Ｒａｃ3 3种同工型形式。Ｒａｃ1和Ｒａｃ3在体内分布广泛 ,而Ｒａｃ2是一种造血细胞特异的小Ｇ蛋白 ,它可通过对ＮＡＤＰＨ氧化酶的作用调节超氧化物的产生。Ｒａｃ有二种存在形式 :有活性的ＧＴＰ结合形式与无活性的ＧＤＰ结合形式。Ｒａｃ和其他小Ｇ蛋白一样 ,可被鸟嘌呤…     

核转运蛋白的结构及功能

核转运蛋白Imp家族是在其核细胞中广泛存在的一类重要的蛋白质,其成员数目众多,在酿酒酵母菌中有一种Impα,而在脊推动物中现已发现8种不同的Impα。在酵母中有14种Impβ,而在哺乳动物细胞中有超过20种不同的Impβ。并且有新成员正在不断地被发现。Impα是由10个ARM重复序列形成的一个α起螺旋结构。Impβ与不同底物结合时,呈现出不同的构象,它也是由2或3个螺旋所组成的延伸的起螺旋结构。Imp家族成员通过Impβ的单独作用或Impα与Impβ1的协作结合其作用底物,在RM的调节下,完成对大分子蛋白质的穿越核膜的转运,并且以这一作用为基础,参与了细胞的信号转导,细胞分裂及生长发育,细胞调亡等重要生命活动。在细胞分裂时,Imp家族还可与Ran一起参与纺锤体的形成。     

受体介导基因治疗存在的主要问题和可能的解决办法

载体是基因治疗的关键因素之一。从总体上来看 ,基因治疗的载体可以分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体介导的基因治疗取得了显著发展 ,是目前基因治疗的主要载体。但是病毒载体具有携带外源基因片段大小受到限制 ( 7ｋｂ左右 )、易引起机体收稿日期 :2 0 0 1 0 3 0 5作者简介 :孙兴会 (1975 - ) ,男 ,硕士生 ;朱运松 (1940- ) ,男 ,教授。免疫反应以及制备、贮存、质量控制比较困难等固有缺点 ,这促进了人们对非病毒载体介导基因治疗的研究。在过去的十多年里 ,人们对受体介导的基因治疗进行了广泛的研究 ,并取得了较大的进展。受体…     

重组尿激酶型纤溶酶原激活物受体在酵母系统中的表达及鉴定

构建截断型可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体（ｕ－ＰＡＲ）的原核及酵母表达质粒并分别在大肠杆菌和Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中高效表达．利用ＰＣＲ扩增截断型可溶性ｕ－ＰＡＲｃＤＮＡ片段,并分别连入酵母及原核表达载体中,构建成表达质粒．后者经诱导表达的蛋白被用于免疫家兔,获得抗ｕ－ＰＡＲ的抗血清,用于对酵母表达产物的鉴定．前者在甲醇的诱导下表达,产物分泌至培养液中．结果表明,原核表达的ｕ－ＰＡＲ蛋白免疫家兔后获得高效价的抗血清,利用此抗血清所作Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ证实酵母表达蛋白具有ｕ－ＰＡＲ的免疫原性,表观分子量４０ｋＤ左右．Ｍｕｔ－表型在第５ｄ为最高（２．５μｇ／ｍｌ）,Ｍｕｔ＋表型在第４ｄ为最高（７．５μｇ／ｍｌ）．因此,构建的可溶性ｕ－ＰＡＲ表达质粒在Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ酵母细胞获得表达,为进一步竞争拮抗受体功能的研究奠定了基础．     

亲和层析纯化HepG_2细胞分泌的PAI－1

本文报道用抗ＰＡＩ－１单克隆抗体（ＭｃＡｂ）亲和层析建立了纯化ＰＡＩ－１的简便方法。经免疫亲和层析,ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００凝胶过滤,从ＨｅｐＧ２细胞培液中分离到糖基化和非糖基化两种形式的ＰＡＩ－１,回收率为８４％,ＰＡＩ－１比活性６．１×１０４ＩＵ／ｍｇ。糖基化ＰＡＩ－１分子量为５０ｋＤ,比活性５．８×１０４ＩＵ／ｍｇ。非糖基化ＰＡＩ－１分子量４３ｋＤ,占总ＰＡＩ－１３０％,仍具有ＰＡＩ－１活性。用ＣｏｎＡ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析进一步纯化得到ＳＤＳ－ＰＡＧＥ纯的糖基化ＰＡＩ－１。