全基因组SHIV-KB9克隆的构建及其在人、猴外周血单核细胞中的复制

将分别携带SHIV-KB9 (SIV/HIV-1 KB9) 基因组的3′端和5′端的两个半长克隆,体外连接成SHIV-KB9全基因组克隆.含有全长基因的质粒培养时易发生同源重组和缺失,采用JM109作为宿主菌以及30℃、低转速的培养条件,可保持质粒的稳定性.通过PCR , RT-PCR 和猴免疫缺陷病毒(SIV) gag p27 核心抗原滴度检测表明感染性克隆SHIV-KB9可有效在人、恒河猴及食蟹猴的外周血单核细胞中复制.     

病毒学面临的挑战及其在新世纪发展的机遇

作为微生物学的一个重要分支,病毒学的发展为提高人类健康水平和促进工农业生产做出了突出贡献.我国病毒学虽然在基础研究领域较为薄弱,但在诸如病毒分离、分类和形态研究以及疫苗研制等领域屡有建树,在动植物病毒病的生物防治和人类病毒病以疫苗为主的综合防治方面都做出了具有国际水平的工作.本文尝试从二十世纪医学病毒学的发展出发分析该学科所面临的机遇与挑战,并探讨我国病毒学界应采取的应对策略.     

马传染性贫血病毒美洲流行株与我国弱毒疫苗株鉴别诊断方法的研究

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)是反转录病毒科慢病毒属的成员,是马传染性贫血病的病原.二十世纪七十年代我国就研制出马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗,成为世界第一个成功地应用该疫苗控制了我国的马传贫的发生[1].而且我国的马传贫弱毒疫苗对异源的美国、古巴和阿根廷等毒株也有很高的保护率[2].因此将我国的马传贫驴细胞弱毒疫苗推向国际市场成为可能.然而目前制约该苗出口的技术问题是现行的OIE推荐的琼脂扩散实验和ELISA等血清学方法不能鉴别自然感染马与我国弱毒疫苗免疫马,针对这个关键问题,本试验采用PCR方法初步建立了一种能够鉴别美洲(美国和阿根廷)流行毒株感染马和我国弱毒疫苗免疫马的实验室检测方法,为我国疫苗能在世界范围内应用提供了配套技术.     

HIV整合酶在大肠杆菌中的表达纯化及其应用

采用pThioHisB系统表达HIV-1整合酶P31蛋白,目的蛋白的表达量达到菌体蛋白的30%左右.通过包涵体洗涤和离子交换层析,蛋白纯度高于95%.用纯化后的P31抗原制备成条带免疫试纸条,检测HIV参考品血清时表现了很好的灵敏度和特异性.本研究为进一步开发HIV-1血清学诊断试剂盒奠定了基础.     

HIV整合酶在大肠杆菌中的表达纯化及其应用

采用pThioHisB系统表达HIV-1整合酶P31蛋白,目的蛋白的表达量达到菌体蛋白的30%左右。通过包涵体洗涤和离子交换层析,蛋白纯度高于95%。用纯化后的P31抗原制备成条带免疫试纸条,检测HIV参考品血清时表现了很好的灵敏度和特异性。本研究为进一步开发HIV-1血清学诊断试剂盒奠定了基础。     

SHIV及其在AIDS疫苗和药物研究中的应用

艾滋病已成为21世纪威胁人类健康的最主要的疾病,最有效的预防措施,就是研制安全有效的疫苗。疫苗安全性和有效性评价,以及疫苗组合的选择和免疫程序的策略,需要在合适的动物模型中进行分析。SIV/恒河猴模型曾被认为是最有效的研究模型。但是,SIV和HIV之间基因的差异,使得这个模型存在很大局限性。研究人员还曾经致力于HIV-1/黑猩猩模型,但伦理学等方面的问题导致该模型也不能被广泛利用[1]。嵌合猿猴/人免疫缺陷病毒(Chimeric simian/human immunodeficency virus,SHIV),是以猿猴免疫缺陷病毒(Simian immunode ficiency virus,SIV…     

广西壮族自治区HIV-1流行毒株的基因序列测定和亚型分析

使用ＰＣＲ技术对１４份广西ＨＩＶ－１阳性感染者外周血单核细胞（ＰＢＭＣｓ）样品进行扩增,获得ＨＩＶ－１膜蛋白（ｅｎｖ）基因的核酸片段,并对其Ｃ２－Ｖ３及邻区３５０－４５０个核苷酸序列进行了测定和分析。结果表明,１４份样品中９份为泰国Ｂ（Ｂ′）亚型,５份为Ｅ亚型毒株。其中Ｂ′亚型毒株的基因离散率为４．２％,与Ａ－Ｅ参考亚型及部分Ｂ亚型代表株序列相比较,与包括泰国、缅甸及云南德宏在内的Ｂ亚型毒株序列十分接近,相互之间基因离散率在３．０％－４．４％的范围内;而Ｅ亚型毒株的基因离散率为２．１％,与国际Ｅ亚型毒株的基因离散率最近,为５．６％,与其它国际参考亚型基因离散率很远,在２１．１％－２７．３％。根据以上数据及其它资料提示,广西存在Ｂ′和Ｅ两种亚型的ＨＩＶ－１的流行,且其Ｂ′亚型毒株的传入,与流行在云南德宏州的相同亚型ＨＩＶ－１毒株密切相关,而Ｅ亚型毒株则可能是由泰国经越南传入广西的     

特异性标记EIAV感染性克隆的构建及鉴定

用FLAG^TM或6His对EIAV疫苗株全基因感染性克隆pFD3的S2分子进行分子标记,以建立EIAV疫苗株与野毒株感染鉴别诊断的方法。标记产物pFD3-FLAG和pFD3-HISADD转染驴胎皮细胞(FDD)后收获衍生病毒并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性。在FDD细胞上盲传至第五代后收获细胞培养上清再感染驴单核巨噬细胞(DL),盲传三代后pFD3-FLAGRT酶活性显示弱阳性,未见明显的细胞病变;pFD3-HISADD为强阳性,且细胞病变效应明显,在电镜下可见明显的病毒颗粒。与父本克隆pFD3相比,在细胞水平上二者复制特性有明显的不同。证明在DL细胞上S2基因的完整性是病毒复制很重要的因素。     

逆向突变型EIAV全长基因组感染性克隆的构建及体外感染性评价

在已有全长基因组感染性克隆 pLGFD3 8的基础上,按照疫苗制作过程中 EIAV结构基因的变化规律,对其中gag基因进行定点逆向回复改造。并在gag突变的基础上增加env 突变位点。将所改造的突变克隆转染驴胎皮肤细胞(FDD)以及驴单核巨噬细胞(DL),并用逆转录酶活性检测和 RT PCR方法验证其感染性。结果发现,衍生病毒感染上述两种细胞均出现明显的细胞病变效应;细胞培养上清可检测到 RT酶活性和 RT PCR阳性。电镜下可见大量典型的病毒颗粒。然而单核巨噬细胞培养病毒感染滴度要明显高于驴胎皮肤细胞培养病毒滴度。驴胎皮肤细胞内嵌合克隆衍生病毒和父本克隆衍生病毒的复制动力学比较分析显示前者的复制比后者略有滞后。此结果为深入研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和疫苗保护机理奠定了基础。