重组人TNF-α在大肠杆菌表达、纯化及生物学活性鉴定

[目的]获得人TNF-α蛋白,并鉴定其生物学活性。[方法]通过对人源TNF-α序列进行密码子优化构建了p Cold-TNFα原核表达载体,完成了TNF-α重组蛋白的表达,建立了两步分离纯化方案,并利用Western Blot和细胞刺激实验检测了重组人TNF-α蛋白抗原性和生物学活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达重组人TNF-α蛋白,经酶切纯化后的人TNF-α蛋白不含标签序列,纯度达95%,收率约70%,并具有良好的生物学活性。[结论]获得具有生物学活性的人TNF-α蛋白,为进一步的中和抗体研究奠定了基础。     

大鼠瘦素基因重组腺相关病毒的构建及在原代神经元细胞中的过表达

目的构建携带大鼠瘦素(leptin)基因的重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),并鉴定其在原代鼠神经元细胞中介导的瘦素过表达,为肥胖症基因治疗研究奠定实验基础。方法提取大鼠脂肪组织总RNA,利用RT-PCR技术,获取目的基因瘦素cDNA,通过重组DNA技术,得到瘦素cDNA与pGEM-T载体的重组质粒,阳性重组子用PCR及测序分析鉴定。用Spe I和EcoR V双酶切将pGEM-Leptin中的瘦素基因片段切出,再克隆到AAV2表达质粒pTR-UF22中,构建瘦素重组AAV2载体pAAV2-CBA-leptin。以pDG作为辅助质粒用HEK293细胞包装AAV2-CBA-Leptin,并用一步重力流柱法纯化病毒,由荧光定量PCR测定病毒基因组DNA的拷贝数即为病毒滴度。然后将AAV2-CBA-Leptin及对照病毒AAV2-CBA-EGFP感染大鼠原代神经元细胞,分别用免疫染色和Western blotting鉴定外源基因在神经元的表达。结果测序证实瘦素基因与GenBank提供的原始序列完全一致。重组载体经酶切鉴定与预期结果完全一致,HEK293细胞包装病毒效果良好,得到滴度为1.5×1012vg/mL纯化的重组瘦素病毒AAV2-CBA-Leptin。Western blotting检测显示AAV2-CBA-Leptin能介导瘦素在大鼠神经元细胞中过表达,并随着病毒量的增加而增强。AAV2-CBA-EGFP感染鼠神经元细胞5d后95%左右的细胞有明显的绿色荧光,免疫染色和DAPI核酸染色显示荧光细胞均为神经元而神经胶质细胞无荧光。结论成功构建并包装了瘦素重组AAV2病毒并可介导瘦素在神经元细胞中高效、特异表达,从而为研究瘦素在中枢神经系统控制体重和糖尿病等方面的功能及基因治疗研究打下基础。     

天津盐渍化农田土壤盐分变化特征

通过对天津农田土壤合盐量及盐分组成的分析,研究了该区盐渍化农田盐分的组成状况和累积特征.结果表明:与蓟县背景对照土壤相比,东丽、津南和汉沽三区盐渍化农田的盐分组成均呈现很大的差异性;非盐渍化农田盐分呈表层累积特征,含盐量随土壤剖面深度的增加而减小,而盐渍化农田表层呈强烈的洗盐、脱盐现象,底层则呈明显的积盐现象;非盐渍化和盐渍化农田盐分的阴离子组成均以HCO3-为主,而阳离子组成则由无盐渍化农田的以Ca2+为主逐渐过渡到盐渍化农田的以Na+为主;盐渍化农田剖面盐分的空间变异性较强,Na+、C1-与SO42-均为表层低深层高,且pH、残余碳酸钠(RSC)、钠吸附比(SAR)及碱化度(ESP)也均比非盐渍化农田高,并呈现出盐化和碱化同步发生的特征.     

GABA/progesterone-induced polyphosphoinositide (PPI) breakdown and its role in the acrosome reaction of guinea pig spermatozoa in vitro

To investigate whether GABA/progesterone (P4) stimulates PPI breakdown and its role in the acrosome reaction (AR), spermatozoa of guinea pig were preincubated in MCM-LCa2+ for 5.5 h and then labeled with [32P]pi for 1 h. Samples were washed through a three-step gradient Percoll, adjusted to 5×107 cells/mL and exposed to 2 mmol/L Ca2+, 5 mmol/L GABA, 10 mmol/L P4 and other agents. Lipids were separated by t.l.c. and radioactivity in spots determined by scintillation counting. The AR was assessed by phase-contrast microscopy. The results showed that (i) when spermato-zoa were treated with GABA, 32P-label diminished rapidly in phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2), phosphatidylinositol 4-phosphate (PIP), and increased in phosphatidic acid (PA). The loss of label from PPI was almost completed by 10 min. The time-course of the AR was much slower than PPI when spermatozoa reached a maximal response by 15 min; (ii) the pattern of PPI hydrolysis and stimulation of AR was similar for the three agonists tested；their potency followed the order A23187＞progesterone≥GABA; (iii) GABA-induced PIP2 hydrolysis and rise in PA and the AR were prevented by inclusion of 10 mmol/L neomycin; (iv) the loss of PIP2 labeling and the increase in PA labeling abolished when spermatozoa were exposed to EGTA or Ca2+ channel blocker. These re-sults indicate that GABA or P4-induced PPI breakdown is an important and essential event in the series of changes to membrane fusion during the AR of guinea pig spermatozoa and this effect is mediated via calcium by activation of phosphatidylinositol-specific phospholipase C.     

两种微生物菌剂对西番莲果渣高温堆肥腐熟进程的影响

研究了在西番莲果渣堆肥体系中加入两种微生物菌剂（福贝和榕风）后的温度、C／N、NH4^＋ -N和NO3^- -N的动态变化及对西番莲果渣堆肥产品品质的影响．结果表明,在西番莲果渣中加入微生物菌剂能增加高温分解持续时间,加快物料C／N降低的速率,促进NH4^＋ -N向NO3^- -N转化,加快西番莲果渣堆肥腐熟化进程．添加福贝和榕风菌剂后,堆肥高温持续时间分别比对照（4d）增加7d和8d;腐熟后堆肥的NO3^- -N浓度分别比对照增加58．0％和64．2％．添加菌种显著增加了西番莲果渣堆肥的N、P、K养分含量,降低了堆肥容重,提高了堆肥总孔隙度和持水孔隙度,改善了堆肥产品的品质．两种菌剂间对西番莲果渣高温腐熟进程的影响没有显著差异,但福贝菌剂更有利于改善堆肥品质．     

10-23型DNA酶作为鉴定mRNA靶点有效性的新工具

10-23DNA酶是能主动切割mRNA的一类反义寡核苷酸.利用10-23DNA酶的直接切割作用验证mRNA结构靶点的有效性.对筛选的绿色荧光蛋白(GFP)基因mRNA的4个靶点平行设计了4条反义寡核苷酸和4条10-23DNA酶,对照组反义寡核苷酸将最佳靶点——靶点2的反义寡核苷酸突变2个碱基,对照组10-23DNA酶将靶点2的10-23DNA酶结合臂中央突变2个碱基.体外4条10-23DNA酶切割mRNA的结果和相应的4条反义寡核苷酸依赖的RNaseH降解结果完全相似,细胞内4条10-23DNA酶对绿色荧光蛋白的表达抑制作用与相应的4条反义寡核苷酸相似,表明10-23DNA酶显示的最佳作用靶点同样是最佳作用效果的反义寡核苷酸结合靶.10-23DNA酶可以作为评价mRNA结构靶点有效性的新工具.     

从典型硝化细菌到全程氨氧化微生物：发现及研究进展

生物硝化过程在全球氮循环中起关键性作用,被认为由氨氮氧化成亚硝酸盐和亚硝酸盐氧化成硝酸盐两个步骤组成,分别由氨氧化微生物(Ammonia oxidizing microorganisms,AOM)和硝化细菌(Nitrite oxidizing bacteria,NOB)催化完成。AOM包括氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria,AOB)和氨氧化古菌(Ammonia oxidizing archaea,AOA),AOB与AOA分布广泛,两者的相对丰度和氨氮浓度密切相关。2015年底,3个硝化螺菌属(Nitrospira)谱系Ⅱ的NOB被证实含有AOM的特征功能酶,包括氨单加氧酶(AMO)和羟胺脱氢酶(HAO),并证明NOB同时具有氨氧化和亚硝酸盐氧化的能力,命名为全程氨氧化微生物(Complete ammonia oxidizer,Comammox)。根据AMO的α亚基基因amoA的相似性将Comammox分为两大分支clade A和clade B。它们广泛分布于自然环境和人工系统,包括土壤(稻田、森林)、淡水(湿地、河流、湖泊沉积物、蓄水层)、污水处理厂和自来水厂等。本文综述了Comammox的发现及其最新的研究进展,并展望了Comammox作为氮循环关键功能菌群的研究方向和应用前景。     

滨海半干旱地区海水灌溉对土壤安全和作物产量的影响

2001至2003年,连续3a在山东莱州地区布置田间试验,研究海水灌溉对土壤安全和作物产量的影响。试验共设4个处理,即CK(未灌溉处理)、25%、50%、75%的海水灌溉处理。结果表明:未灌溉处理土壤中的总盐量呈明显积累趋势,2003年较2001年增加了1.3倍;25%和50%的海水灌溉处理,2001年土壤盐分明显积累,此后两年有逐年脱除的趋势。2003与2001年相比,脱盐率分别达到34.9%和41.0%。连续3a海水灌溉后,除CK外,各处理耕层中的盐分较为稳定,且处于较低水平;CK和50%的海水灌溉处理,60~100cm的土层中的盐分明显积盐,而其它处理均未表现出积盐趋势。25%的海水灌溉处理土壤钠吸附比明显高于50%、75%的海水灌溉处理,但仍然未达到10mmol/L。2001和2002年,25%和50%的海水灌溉处理,较未灌溉处理增产效应显著。因此,25%和50%的海水灌溉耐盐作物菊芋,能够保证土壤安全和作物高产高效。     

siRNA作用效果的靶点依赖性

小分子双链RNA(siRNA)可以高效、特异地沉默目的基因表达 ,为基因功能研究及基因治疗提供了新工具。近年来研究表明针对基因mRNA不同位点随机设计的siRNA在作用效果上存在差异 ,siRNA作用效果有序列依赖性 ,而且与其在基因mRNA上的结合部位的高级结构有关 ,与反义核酸发挥作用的靶点依赖性类似。这一性质对设计高效siRNA为基因功能和基因治疗研究提供指导作用。     

山西平陆黄河湿地植物分类学多样性

传统的物种多样性通常使用物种数量指标α和β等多样性指数进行测度,由于其对取样和样本大小有依赖关系且极其敏感,因此取样方法的不同会对多样性的结果产生显著影响。分类学多样性方法基于分类学系统关系测量物种多样性,弥补了传统方法的不足,同时面对各种变量和不受控制的取样具有稳健性,同时也考虑了集合的分类学均匀度。不仅能反映植物群落多样性,还能间接反映环境与扰动间的关系,用于识别生态系统或生境是否处于退化阶段。为了探究平陆黄河湿地的物种多样性,检验分类学多样性方法在植物生态学方面的应用,选取了16个样地进行植物调查,并结合历史资料整理了种子植物名录,结果表明平陆黄河湿地共有植物368种,隶属于36目67科213属。含种最多的科为菊科和禾本科,分别为54种和45种。应用平均分类学差异指数(Δ+)和分类学差异变异指数(Λ+)研究了各样地的植物物种多样性:Δ+和Λ+的理论平均值分别为74.24和480;位于三门峡大坝上游和下游的样地和不同群落类型的分类学多样性均没有显著差异(P0.05)。受人类干扰较大的车村和鳖干平均分类学差异指数值显著较低,Δ+分别为62.28和67.41,位于95%的置信漏斗外;而水分条件较好且人为干扰较少的南沟渡口和三湾湖平均分类学差异指数值最高为分别81.30和79.94。车村的分类差异变异指数值最高为814.44,其物种在不同分类阶元分布最不均一,涧北的分类差异变异指数值最低为423.31,其物种分布相对较均一。传统的多样性方法难以全面的反映某个区域的物种组成、分布和多样性,此外分类学多样性的高低与物种数量的多少没有一定的相关关系,Δ+与S、Λ+与S的相关关系分别为-0.257和-0.187(P0.05)。耕作、生态旅游、日常活动等人为干扰因素可能是造成平陆黄河湿地分类学多样性降低及物种在不同分类等级间分布不均匀的主要原因。