Rab蛋白的结构、功能及进化

Rab蛋白是小分子GTP结合蛋白家族(small GTP-binding proteins)中最大的亚家族,大约由200个氨基酸组成,由保守的G结构域与高度可变的N端和C端组成。Rab蛋白作为细胞内囊泡运输的分子开关,与其上游调控子和下游特定的效应子相互作用,并与GTP的结合和水解过程相偶联,在囊泡运输的不同阶段发挥作用。对不同Rab蛋白调控囊泡运输的研究有利干全面理解细胞内各类囊泡定向运输的分子动力学机制。     

游仆虫重组核糖体蛋白L11与肽链释放因子的体外相互作用分析

核糖体蛋白L11(ribosome protein L11)是一种高度保守的蛋白质．为研究真核生物的核糖体蛋白L11的功能,从八肋游仆虫（Euplotes octocarinatus）大核基因组中克隆到核糖体蛋白L11基因,构建了重组表达质粒pGEX-6p1-L11,通过谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和层析,纯化了重组融合蛋白GST-L11．Pull down 分析显示,八肋游仆虫的核糖体蛋白L11与第一类肽链释放因子eRF1a可以在体外相互作用．这一结果提示,与原核生物一样,低等真核生物的核糖体蛋白L11在肽链终止过程中可能起一定的作用．     

蛋白质合成肽链释放因子的多功能性

肽链释放因子在蛋白质合成终止过程中,对新生肽链从核糖体上释放起重要作用。第一类肽链释放因子识别终止密码子,水解肽酰-tRNA酯键;第二类肽链释放因子是一类依赖于第一类肽链释放因子和核糖体的GTP酶,促进第一类肽链释放因子发挥肽链释放的功能。最近的研究表明,肽链释放因子不仅在细胞内蛋白质合成终止过程中起重要的作用,其在细胞的骨架形成,尤其是细胞有丝分裂过程中对纺锤体的形成起重要的作用。两类肽链释放因子还与其他功能蛋白质相互作用,表现出多功能蛋白质的特征。     

Intein介导的重组昆虫毒素BmK IT在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及活性分析

为获得重组蝎昆虫毒素BmK IT,通过PCR方法在BmK IT基因的3′端融合了编码6个组氨酸残基的核苷酸序列,将其插入原核表达载体pTWIN1的内含肽 Ssp DnaB Intein基因下游的多克隆位点（MCS）。将获得的表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）中,用IPTG诱导融合蛋白表达。用Ni-NTA亲和层析柱从菌体裂解液中纯化了CBD-Intein-BmK IT^his6融合蛋白,并在柱上诱导Intein自剪切,成功去除融合子CBD-Intein。通过Superdex 75凝胶过滤层析获得了纯度达95%以上的BmK IT^his6蛋白,该蛋白不仅具有正确的二级结构而且有生物活性。     

八肋游仆虫一种富含三核苷酸重复序列的新基因GARP的克隆与序列分析

人类基因中三核苷酸重复序列拷贝数的异常扩增, 可导致多种神经系统疾病。一种富含GAA三核苷酸的GARP (glutamic acid-rich protein)基因从八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)大核文库中筛选获得。大核中该基因的染色体全长460 bp, 基因两端具有下毛类纤毛虫大核特有的端粒序列(C₄A₄C₄A₄C₄A₄C₄), 开放读框内含有一个TGA_(88-99)密码子, 在游仆虫中编码为半胱氨酸。经DNA Star 软件分析, 该基因编码的蛋白质由112个氨基酸组成, 预测其分子量为13 kDa, 等电点为3.82, 含有四个 [[alpha]] 螺旋和一个 [[beta]] 折叠。小核中对应的该基因含有两个内部删除序列, IES1 和IES2。IES1和IES2分别长41 bp, IES1以GA二核苷酸直接重复为删除信号, IES2以TA二核苷酸直接重复为删除信号。RT- PCR 证明该基因具有转录活性。     

东亚钳蝎神经毒素在大肠杆菌中的表达

以山西风陵渡东亚钳蝎（ＢｕｔｈｕｓｍａｒｔｅｎｓｉＫａｒｓｃｈ）的尾腺总ＲＮＡ为模板,根据已知的蝎神经毒素保守氨基酸序列设计引物,利用ＰＣＲ技术,扩增并克隆了两个蝎神经毒素基因．序列分析表明,由两个基因导出的氨基酸序列（ＢｍＫＭｍ１和ＢｍＫＭｍ２）与已知的蝎神经毒素ＢｍＫⅠ、ＢｍＫⅡ、ＢｍＫⅢ、ＢｍＫＭ１、ＢｍＫＭ９有很高的同源性．将ＢｍＫＭｍ２基因重组到大肠杆菌分泌型表达载体ｐＥｘＳｅｃ１中进行表达．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明表达产物被分泌到细胞周间质及培养液中．经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化后的蛋白质注射小白鼠表明表达产物有生物学活性     

EoRab11a在游仆虫及HEK293T细胞中的定位

Rab11是一种在真核生物细胞生命活动过程中发挥多种调控作用的小分子GTP酶.EoRab11a是八肋游仆虫中的Rab11蛋白同源物,为了解EoRab11a蛋白在细胞中的功能,本研究将EoRab11a基因克隆到哺乳动物表达载体pEGFP-C2中,构建重组表达质粒pEGFP-C2-EoRab11a,转染HEK293T细胞并观察其细胞定位.在间期HEK293T细胞中,EoRab11a定位于细胞核附近;在游仆虫细胞中,EoRab11a具有相似的分布模式.在HEK293T细胞的胞质分裂过程中,EoRab11a在分裂沟附近、分裂沟收缩区、以及最后形成的中间体处分布,提示EoRab11a可能参与了胞质分离过程中分裂沟及中间体处的膜泡运输事件.     

人mRNA输出因子Gle1与肽链释放因子相互作用上调HeLa细胞中蛋白质翻译终止活性

Gle1蛋白是一种mRNA核输出因子. 最近有研究报道Gle1蛋白参与了酿酒酵母的蛋白质翻译终止过程. 为了探讨Gle1蛋白是否在其它生物中也具有同样的功能, 本研究利用酵母双杂交、免疫共沉淀以及免疫共定位等方法证实了人Gle1蛋白与参与蛋白质合成终止的两类肽链释放因子均能够相互作用, 提示hGle1蛋白可能在人细胞中参与了蛋白质的翻译终止过程. 进一步在HeLa细胞中利用双荧光素酶报告系统分析人Gle1蛋白对蛋白质翻译终止的影响,结果显示, hGle1的过表达能促进细胞内蛋白质的翻译终止. 为进一步探讨hGle1蛋白在蛋白质合成中的作用机制奠定了基础.     

第一类肽链释放因子结构与功能研究的新进展

蛋白质生物合成过程的终止是由于第一类肽链释放因子识别终止密码子,并导致肽酰-tRNA酯键水解,释放出新合成的多肽链．近期,通过冷冻电镜、结晶学、核磁共振、分子动力学和生物化学等方面的研究,使第一类肽链释放因子的结构与功能逐渐清晰．对近期的研究进行了分析和整理．     

原生动物八肋游仆虫cDNA文库的构建

细胞内蛋白质合成过程是一个由多种蛋白质相互作用参与调节的开放系统,形成了复杂的mRNA代谢和蛋白质翻译为核心的基因表达调控的网络和信号转导途径。【目的】为了获得更多参与调节蛋白质合成终止过程的蛋白质种类和功能信息,进一步了解其中的网络和信号转导途径,本研究构建了原生动物八肋游仆虫的cDNA文库。【方法】构建过程严格遵循Clontech公司的BD MatchmakerTM Library ConstructionScreening kit提供的方案进行文库构建和筛选.【结果】首次得到了可用于筛选功能基因的原生动物纤毛虫的cDNA文库,文库滴度为2.437×107cfu/mL。利用第二类肽链释放因子为诱饵,筛选得到了一些可能与之相互作用的蛋白质,其中包括一个可能编码RNA解旋酶的基因序列。该文库为进一步筛选和研究八肋游仆虫功能基因提供了便利的平台。