手性医药化学品生物催化绿色制造

生物催化具有选择性强、催化效率高、反应条件温和、环境友好等优点,广泛应用于传统化学方法不能或者不易合成的手性化合物的生产过程中,已成为化学合成法的一种重要补充。同时,生物催化能够更好地解决资源、能源和环境方面的压力,维持和谐的生态环境,促进工业的可持续发展。近年来,生物催化技术已在手性医药化学品产业化生产中得到了广泛的应用,有效地实现了手性医药化学品的绿色制造。本文就生物催化介入的手性医药化学品的产业化技术和过程进行介绍。     

静息细胞转化生产3-羟基丙酸的条件优化

本文研究了静息细胞生物转化生产3-羟基丙酸的反应体系。考察了以甘油为底物,利用静息细胞转化生产3一羟基丙酸的相关因素,确定了最佳的转化条件：细胞浓度20g／L,甘油浓度20g／L,辅酶VB12浓度10mg／L,NAD＋浓度0．15mmol／L,温度35℃,反应体系为0．05mol／LpH7．0Tris—HCl缓冲液。在上述条件下反应6h后,3-羟基丙酸的产量达到为3．17g／L,底物转化率为28．33％。由上述结果可知,采用静息细胞转化法为3-HP的生物合成提供了一种可能的方法。     

串珠镰孢霉D-泛解酸内酯水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用D_泛解酸内酯水解酶N末端序列,并根据NCBI中公布的D_泛解酸内酯水解酶cDNA序列设计了一个特异引物,该引物结合Oligo(dT) 1 5,以串珠镰孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0 5 36mRNA反转录得到的总cDNA为模板进行扩增,获得约1 5kb左右的片段,将其克隆到T载体上进行测序,对测得的序列进行分析,重新设计了一对引物,并在引物两端分别加上限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的识别位点序列,利用热启动PCR成功地扩增出了D_泛解酸内酯水解酶基因,基因片段长度为114 6bp ,该序列同来源于尖镰孢霉菌(F .oxysporum)AKU 370 2菌株的编码D_泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的同源性为90 0 6 %。将所得片段定向克隆到pTrc99a载体中,转化至JM10 9感受态细胞,筛选出了阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,进行SDS_PAGE电泳,检测出在约4 0kD处有一蛋白表达带。对两株重组基因工程菌的比活力进行测定,结果分别为37U和4 1U。     

改进酶稳定性的定向进化技术

酶作为一种生物催化剂,以其独特的优良特性,在绿色化学和清洁生产中得到了广泛的应用。随着酶定向进化技术的建立和发展,通过定向进化改进酶稳定性的研究越来越多。详细综述了各种定向进化方法的特点及在提高酶稳定性方面的应用,并从结构和功能的角度进一步解释了相关机理。     

代谢工程改造大肠杆菌生产l-高丝氨酸

L-高丝氨酸是一种非必需氨基酸,在工业生产中常被用作重要的平台化合物和添加剂。为提高产物合成效率,本文以实验室构建的L-高丝氨酸高产工程菌大肠杆菌Escherichia coli H0-0作为底盘菌株进行代谢改造。首先对ppc和pyc_(cg)~(P458S)基因进行过表达来优化柠檬酸循环,然后通过thrA~(C1034T)和lysC_(cg)~(C932T)提高产物的合成效率,随后对iclR基因进行了敲除以减少副产物的积累。同时导入scrA、scrB、scrK三个蔗糖代谢基因使大肠杆菌能利用蔗糖作为碳源进行发酵。L-高丝氨酸产量从3.2 g/L提高至11.1 g/L,本研究也为L-高丝氨酸的工业化生产奠定了基础。     

重组青霉素G酰化酶拆分制备（S）-邻氯苯甘氨酸

对产青霉素G酰化酶的重组枯草芽胞杆菌发酵产酶条件进行优化,确定优化后的发酵条件：可溶性淀粉10g/L、蛋白胨12g/L、酵母粉3g/L、NaCl10g,／L;pH7．5、培养温度37℃、装液量80mL（500mL三角瓶）、培养28h,青霉素G酰化酶的表达水平由最初的7．34U／mL提高至18．23U／mL。以表达青霉素G酰化酶的枯草芽胞杆菌发酵液为酶源,在水相中对映选择性催化N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸制备（S）-邻氯苯甘氨酸,当底物浓度为100mol／L时转化4h,转化率达44．2％。对底物浓度为80mmoL／L反应液中的（S）-邻氯苯甘氨酸进行分离,达到理论收率的94．29％（以N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸的0．5倍摩尔量为理论产率）,e．e．值大于99．9％。170℃条件下,N-苯乙酰-（R）-邻氯苯甘氨酸与苯乙酸共熔消旋为N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸可用于循环拆分。     

维生素A棕榈酸酯的分离纯化与分析

本文对脂肪酶利用维生素A醋酸酯作为底物催化合成维生素A棕榈酸酯的分离纯化作了研究。确定了维生素A棕榈酸酯的萃取条件:萃取体系为乙醇/水和正己烷,乙醇浓度80%,乙醇/水与正己烷的体积比为5:1,萃取温度-20℃,萃取级数为5次,最终维生素A棕榈酸酯质量分数达到96.4%。萃取后,利用硅胶柱层析进一步纯化,条件为:反应液1mL上硅胶柱层析(硅胶200~300目,柱20mm×280mm),流动相为乙酸乙酯/石油醚(1:9,V/V),流速为68.5mL/h,5mL/管收集洗脱液,并用高效液相色谱(HPLC)鉴定,结果表明硅胶柱层析可以完全分离维生素A醋酸酯和维生素A棕榈酸酯。     

3-羟基丙酸分批发酵过程中的pH控制策略研究

本文利用重组大肠杆菌以甘油为底物发酵合成3．羟基丙酸,考察了不同pH对3．羟基丙酸产量及菌体生长的影响,发现在pH6．5条件下,细胞比生长速率达到最大值,延迟期也相对较短;而pH7．0有利于3-羟基丙酸的合成,控制pH7．0可以使3-羟基丙酸产量达到7．39g／L。基于不同pH条件下对细胞比生长速率和3-羟基丙酸比生成速率的分析,提出3．羟基丙酸分批发酵过程中的pH控制策略,即在发酵过程前5h将pH控制在6．5,5h～15h控制pH为7．0,此时有利于细胞生长;而后在15h-25h控制pH为7．5,25h后控制pH为7．0,从而使细胞具有较高的3．羟基丙酸比合成速率。在此控制策略下经过34h发酵3-羟基丙酸的终产量达到8．76g／L,比pH7．0条件下的3-羟基丙酸产量提高了18．54％。     

南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造

南极假丝酵母脂肪酶B是用途最为广泛的脂肪酶之一,可用于许多有机化合物、医药中间体等的合成.为了改善南极假丝酵母脂肪酶B的催化性能,提高其环境适应性,同时提高蛋白的表达量,降低生产成本,从而使其更适于工业化应用,许多针对酶蛋白分子的修饰及改造方法已在南极假丝酵母脂肪酶B中得到大量应用.本文从化学修饰、理性设计和非理性设计3个方面详细综述了南极假丝酵母脂肪酶B的修饰与改造的关键技术,包括定点突变、蛋白质融合、易错PCR和DNA改组等,同时也介绍了以上技术在改良南极假丝酵母脂肪酶B特性方面的诸多成功实例.     

酶的定向进化及其应用

综述了生物催化剂（酶）分子定向进化的产生、原理、方法及应用,深入阐述酶分子定向进化过程中的相关问题,重点介绍了易错PCR（Error-prone PCR）和DNA改组（DNA shuffling）等几种典型的酶定向进化方法与成功实例,展望了生物定向进化研究的发展前景。