九种重要经济动物二级抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗9种重要经济动物的二级抗体,并进行辣根过氧化酶标记,为经济动物血清学检测系统的建立提供工具。方法利用饱和硫酸铵沉淀粗纯抗体后,再利用protein A或protein G亲和层析的方法进一步纯化动物血清IgG,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法纯化兔抗经济动物的二级抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的二级抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting考察标记抗体的特异性。结果纯化了家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物的血清IgG,免疫双扩散法测定兔抗血清效价均达到1：32,并对纯化的兔抗家猪,绵羊、山羊、牛、马、驴、狐狸、貉和黑貂9种重要经济动物二级抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1：（2000～15000）左右,Western blots显示标记抗体具有很好的特异性。结论成功制备了HRP标记的兔抗9种重要经济动物的二级抗体,为经济动物血清学检测体系的建立提供了工具。     

蝙蝠血清IgG的纯化及兔抗蝙蝠IgG酶标抗体的制备

目的纯化蝙蝠血清IgG,制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体。方法采用亲和层析纯化法纯化蝙蝠血清IgG,SDS-PAGE电泳鉴定蝙蝠IgG纯度。免疫大白兔制备兔抗蝙蝠IgG抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价,亲和层析纯化法纯化抗血清IgG。用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,直接ELISA和Western blot法对兔抗蝙蝠IgG酶标抗体进行工作浓度测定。结果纯化的蝙蝠血清IgG,其SDS-PAGE测定纯度大于95%;免疫大白兔所制备的抗血清免疫双扩散效价为1∶64;用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,其直接ELISA和Western blot工作浓度分别为1∶12800和大于1∶2000。结论制备了蝙蝠血清IgG的抗血清和酶标抗体,为蝙蝠的血清学检测体系提供了技术和资源储备。     

兔抗五种鱼免疫球蛋白抗体的制备和HRP标记

目的制备兔抗鱼类免疫球蛋白抗体并进行辣根过氧化酶标记,为鱼类血清学检测系统的建立提供工具。方法利用proteinA亲和层析的方法纯化鱼血清免疫球蛋白,免疫大耳白兔制备抗血清,利用免疫双扩散来检测抗血清的效价,并用Protein A亲和层析的方法来纯化兔抗鱼免疫球蛋白的抗体,采用简易过碘酸钠法对纯化的兔抗鱼免疫球蛋白的抗体进行HRP标记,通过ELISA方法测定标记抗体的效价,并利用Western blotting来考察标记抗体与其他常见鱼类血清蛋白间的交叉反应。结果纯化了鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼血清免疫球蛋白,免疫双扩散法测定兔抗这五种鱼免疫球蛋白的抗血清效价均达到1∶32,并对纯化的兔抗鳙、鲤、乌鳢、黄鳝、鲈五种鱼类免疫球蛋白的抗体进行了HRP标记,ELISA测定标记抗体的效价达到1∶10000左右,Western blots显示标记抗体与部分其他鱼类免疫球蛋白之间存在不同程度的交叉反应。结论成功制备了HRP标记的兔抗鱼类免疫球蛋白抗体,为鱼类血清学检测体系的建立提供了工具。     

结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因真核表达载体的构建

目的构建结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因,并对其在体外真核细胞中进行表达。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv株基因组中分别扩增Ag85B、Esat6、HspX基因,插入到pUC19-T载体,序列测定正确后,将融合基因再次克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）。重组质粒经酶切鉴定并测序正确后,用MegaTran1.0转染293T细胞,并用Western-Blot检测目的蛋白的表达。结果 Western-blot检测到分子量大小约65 kDa的目的蛋白。结论成功地构建了结核分枝杆菌Ag85B-Esat6-HspX融合基因的真核表达载体,且该重组载体可在体外真核细胞中获得特异性的表达。     

血清E型沙眼衣原体的Real-time PCR定量分析

目的沙眼衣原体感染是最常见的性传播疾病,本文拟建立一种准确快速、标准化的感染动物组织衣原体载量检测体系。方法体外扩增感染用沙眼衣原体血清E型,克隆衣原体特异基因OMP1基因片段作为标准品,用Real time PCR法测定衣原体基因组拷贝数进行衣原体定量。结果 Real time PCR在OMP1基因片段200至2×108拷贝检测结果成线性,在模板中加入小鼠基因组未出现非特异扩增,同时未影响扩增效率。结论针对衣原体特异基因OMP1的实时定量PCR方法可以较为灵敏的特异的定量检测感染动物样本中的衣原体。     

宠物对人类健康的潜在威胁

宠物是多种人兽共患病病原的宿主和传播媒介,由于传统宠物、另类宠物和进口宠物的增多,宠物来源的感染性疾病有了高发的趋势。本文总结了狗、猫、啮齿类、鸟类、鱼和爬行类宠物可能带有的人兽共患病病原,引发的疾病和传播途径。并概括了防控宠物源性感染性疾病的防控措施。     

爬行动物的体液免疫

爬行动物针对颗粒性和可溶性抗原,能够快速、有效的产生抗体。爬行动物血清中的抗体主要包括高分子量的免疫球蛋白（HMWIg）和不止一种的低分子量免疫球蛋白（LMWIg）,爬行动物中还有在亲代和子代间传递的免疫球蛋白Ig Y。目前爬行动物免疫球蛋白的纯化方法主要有：硫酸铵沉淀法、联合凝胶过滤层析和离子交换层析法、Protein A亲和层析法。研究爬行动物体液免疫对研究动物免疫的进化及对病原控制具有重要意义。     

肺炎克雷伯氏菌特异性抗原的筛选与鉴定

目的寻找肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）血清学检测用特异性抗原。方法双向电泳分离K.pneumoniae总蛋白,通过免疫印迹（Western blotting）与常见病原菌的多抗反应筛选特异性抗原蛋白,原核表达该蛋白并用ELISA法验证。结果获得K.pneumoniae的双向电泳图谱。寻找Western blotting中与K.pneumoniae自身多抗反应而不与与其它病原菌多抗反应的蛋白,质谱鉴定为酸性磷酸酶（Acid phosphatase,GI：238894261）。经表达纯化并以酶联免疫吸附试验（ELISA）验证,证明该蛋白作为包被抗原的灵敏度高,特异性强。结论 K.pneumoniae酸性磷酸酶是适用于该菌感染检测特异性抗原蛋白。     

耐药结核分枝杆菌感染动物模型所用菌株的筛选

本研究通过小鼠体内实验检测我国部分地区结核分枝杆菌耐药菌株的毒力,以筛选耐药结核分枝杆菌感染动物模型所用菌株。收集从我国部分省份98例结核病患者痰培养液中分离出的结核分枝杆菌,用比例法药敏试验进行结核分枝杆菌一线和二线药物的药敏试验,筛选出对二线药物敏感而对一线药物利福平或异烟肼耐药或敏感的菌株,然后进行小鼠体内毒力实验,对异烟肼耐药相关基因katG和利福平耐药相关基因rpoB测序并进行基因突变分析。从98株菌中筛选出药物敏感谱清晰的40株,进行小鼠体内毒力实验。结果显示,共35株半数死亡时间≤H37Rv的半数死亡时间,其中18株耐利福平合并耐异烟肼、5株单耐利福平,7株单耐异烟肼、5株对利福平和异烟肼均敏感。通过小鼠毒力研究,分别筛选出基因背景清晰,半数死亡时间≤7d的耐利福平合并耐异烟肼的菌株1株、半数死亡时间≤7d单耐利福平和异烟肼的菌株各1株,作为耐药结核分枝杆菌感染小鼠模型所用菌株及进一步进行豚鼠等其他动物模型感染用候选菌株。     

根癌农杆菌介导的大豆遗传转化

农杆菌介导法是大豆遗传转化的重要方法之一 ,许多实验室应用该方法得到了转基因大豆 ,但目前使用该方法进行转化的效率还比较低 ,尚需深入研究。农杆菌菌株、大豆基因型、组织培养条件、T-DNA的转移效率和转化后的筛选模式都会影响大豆转化的效率。概述了近年来根癌农杆菌介导的大豆遗传转化的一些重要成果 ,以及转化过程中大豆的易感性与农杆菌的转化能力、乙酰丁香酮促进vir基因活化、转化的受体系统和巯基混合物减轻受体材料的褐化、提高T DNA的转移效率等几个重要因素的研究进展 ,并介绍了转化中常用的几个筛选标记基因 (nptⅡ、hpt、bar基因和突变的ahas基因 )及通过共转化法去除标记基因的方法 ,同时对今后研究的重点进行了讨论.