常氏肝癌细胞cDNA文库的构建及ADAMs相关基因的免疫筛选与序列分析

抽提常氏肝癌细胞的总RNA,以oligo(dT)为引物,通过两次转换模板,采用LD-PCR合成全长cDNA,在cDNA两端引入SfiI的酶切位点。以λTriplEX2为载体经过包装后构建了常氏肝癌细胞cDNA表达文库。以ADAMs通用抗体,用免疫筛选技术从常氏肝癌cDNA文库中筛选出22个阳性克隆,经测序分析和BLAST检索,证实其中一个为新基因,部分区域具有蛋白酶的功能,对该基因进行了GenBank登录,获注册号为AY078070。该基因的克隆为研究ADAMs相关基因的功能奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌类肠毒素K与GFP融合蛋白工程菌的构建及其表达蛋白生物学活性分析

目的:构建携带金黄色葡萄球菌类肠毒素K(staphylococcal enterotoxin-like K,SElK)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因的工程菌,并对SElK-GFP融合蛋白进行初步生物学活性分析。方法:利用PCR和Overlap PCR克隆获得SElK-GFP融合基因,并插入pET28a表达载体中,通过菌落PCR,质粒双酶切及测序验证后,将构建成功的pET28a-SElK-GFP质粒转化到E. coli BL21菌株中进行诱导表达,通过Ni+亲和磁珠试剂盒纯化获得SElK-GFP融合蛋白;并利用MTT法检测SElK-GFP刺激小鼠脾淋巴细胞增殖; ELISA法检测SElK-GFP尾静脉注射后小鼠血清中细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌水平。结果:成功构建能够表达SElK-GFP融合蛋白的工程菌,纯化获得高纯度的SElK-GFP融合蛋白可观测到明显的绿色荧光,融合蛋白生物学活性分析表明,SElK-GFP能够呈剂量依赖性地显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖;同时ELISA检测发现SElK-GFP可显著增加小鼠血清中细胞因子IL-2及IFN-γ的分泌水平。结论:成功克隆、表达及纯化获得高纯度的SElK-GFP融合蛋白,其不仅保留了SElK的超抗原活性,同时兼具GFP绿色荧光的可视性,为深入研究SElK生物学活性提供有利工具。     

金葡菌类肠毒素K原核表达载体构建及其生物学活性分析

目的:金葡菌类肠毒素K(SElK)原核表达载体构建及其生物学活性初步分析。方法:通过常规分子生物学技术将SElK基因片段插入载体p ET-28a中,阳性单菌落扩大培养,诱导目的基因表达后通过Ni+亲和层析纯化SElK重组蛋白;小鼠脾淋巴细胞增殖实验及尾静脉注射后血常规检测SElK超抗原活性;进一步通过检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)活性及尿素(Urea)和肌酐(CR)含量来评价SElK潜在肠毒性。结果:成功构建SElK原核表达载体,并通过Ni~+亲和层析获得高纯度SElK重组蛋白(95%);随后的超抗原活性检测发现SElK能够在体外刺激小鼠脾淋巴细胞显著增殖,尾静脉注射后能够有效地刺激血液中淋巴细胞增殖;最终的肠毒性检测结果发现SElK能够显著增加血清中AST活性及Urea含量。结论:成功构建并纯化获得高纯度SElK重组蛋白,并对其超抗原活性及潜在肠毒性进行初步分析,为开发更优的抗肿瘤制剂提供备选药物。     

大鼠部分肝切后血清对体外培养肝细胞的刺激作用

目的探讨大鼠部分肝切后血清对体外培养肝细胞生长状况的影响。方法对Sprague-Dawley大鼠进行肝部分切除,分别在术后第12、24、36h于心腔内穿刺取血,制备刺激血清。采用酶消化法分离获取Sprague-Dawley乳鼠的肝细胞,在加有10％上述刺激血清的DMEM培养基中进行肝细胞体外培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状态,采用免疫细胞化学方法检测肝细胞中白蛋白和纤维蛋白原的表达情况。结果发现在肝切后血清刺激作用下,原代培养的肝细胞生长加快,存活时间增长。细胞传代培养后仍用制备血清加以刺激,可产生胶原样细胞外基质,并且在基质上粘附的肝细胞呈现克隆样生长状态,其胞浆内白蛋白和纤维蛋白原均呈阳性表达。结论研究初步表明,体外培养乳鼠肝细胞时加入大鼠部分肝切后血清,可以有效刺激细胞的生长,促进细胞外基质的产生,从而利于肝细胞在体外较长时间存活、增殖和功能保持,同时此种肝细胞体外培养方式还为肝脏细胞生物学研究增添了新的实验途径。     

鸡胚发育早期Sonic Hedgehog在脊髓中的异位表达对形态结构及相关蛋白表达的影响

该文主要分析音猬因子（Sonic Hedgehog,Shh）在鸡胚发育过程中对脊髓形态结构的形成和相关蛋白表达的影响。实验过程采用鸡胚带壳开窗培养技术,待胚胎发育至第3 d,将2μg/μL pCAGGS-Shh和0.25μg/μL pCAGGS-GFP质粒以1：8浓度混合,将0.1~0.5μL混合液准确地注射到神经管,在电压18 V、每次脉冲60 ms、间隔100 ms、电脉冲6次的条件下进行定时定位活体电转基因,电转后6 h开始到5 d分别收集胚胎,冰冻切片,采用荧光免疫组化和DAPI染色观察组织形态结构及相关蛋白的变化。结果表明,电转后6 h便可以观察到GFP的表达,24 h时Shh在脊髓中的异位表达能够诱导转录因子Nkx2.2（NK2 homeobox 2）的表达,并且能够抑制Pax7（paired-type homeobox 7）的表达,而Shh异位表达时脊髓的结构发生了明显的改变;说明Shh作为脊髓发育过程重要的信号分子,其异位表达能够诱导和抑制相关蛋白的表达,影响脊髓正常发育。