应用活体骨髓瘤细胞制备单克隆抗体

【目的】用活体骨髓瘤细胞SP2/0做融合提高融合率制备单克隆抗体,并与常规方法比较效果。【方法】将SP2/0细胞打到8周龄的SPF级BALB/c小鼠皮下,待实体瘤生长到直径达2～3cm时无菌解剖取实体瘤,分离出骨髓瘤细胞进行融合。同时用培养基培养SP2/0细胞进行融合做比较,分两组进行。比较两种方法的融合率以及两种方法制备出来的单克隆抗体的相对亲和力。【结果】做了6次融合,实体瘤融合组融合率为70.4％,常规法融合组44.6％,两种方法制备单抗的相对亲和力均达到1:100000以上。【结论】利用活体实体瘤细胞进行融合能明显提高细胞融合率。     

重组nkx2.5腺病毒抑制过氧化氢诱导的H9c2细胞凋亡

为研究心脏发育关键基因nkx2.5的功能及应用价值,构建Ad-Nkx2.5重组腺病毒,并检测nkx2.5过表达拮抗氧化应激损伤的效应及机制。采用AdEasy腺病毒表达系统构建Ad-Nkx2.5重组腺病毒,建立H2O2诱导H9c2心肌细胞凋亡模型,分别用Ad-Nkx2.5重组病毒或对照病毒感染细胞,采用Hoechst33342染色观察细胞形态变化、MTT法检测细胞存活率,免疫印迹检测caspase-3活化、细胞色素C的胞浆含量。并通过Real-timePCR检测凋亡相关基因bcl-2和bax表达。结果发现,nkx2.5过表达促进H9c2细胞存活,抑制H2O2诱导的caspase-3活化及线粒体细胞色素C的释放。Nkx2.5过表达上调bcl-2表达,显著下调H2O2诱导的bax表达。并发现H2O2对Nkx2.5核定位无明显影响。结果显示重组腺病毒介导的Nkx2.5过表达可通过调控凋亡相关基因表达,抑制线粒体凋亡途径,保护心肌细胞抗氧化损伤。     

苜蓿中华根瘤菌与耐盐有关DNA片段的亚克隆和测序分析

将苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042B与耐盐有关的4kb ClaⅠ DNA片段克隆在pML122上,用HindⅢ酶切下其2.4kb DNA片段,回收后与pBBR1\|MCS2连接,然后转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,筛选到转化子GS2〖DK〗。将残留在pML122上16kb ClaⅠ\|HindⅢ DNA片段连同质粒一起回收,让其自连,转化大肠杆菌S17-1,得到转化子GS0。以GS0为供体,042B的盐敏感突变株GZ17为受体,进行二亲本杂交,没有得到接合子。以GS2为供体,GZ17为受体,在辅助质粒pRK2013的协助下,进行三亲本杂交,筛选到接合子GG2,获得2.4kb HindⅢ与耐盐有关的DNA片段。将此片段连接到测序载体pGEM\|7Zf(+)上进行测序。测序结果表明,该24kb HindⅢ DNA片段含有3个开放阅读框(ORF)。在此基础上再一次亚克隆,获得19kb与耐盐有关的DNA片段。     

苜蓿中华根瘤菌042B共同结瘤基因nodABC的克隆与序列分析*

根瘤菌的nodABC和nodD在结构和功能上保守,在不同的菌种之间能够互换〔1〕,是目前所有供试的豆科植物结瘤所必不可少的,称为共同结瘤基因。另一类是寄生专一性结瘤基因,如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的nodPQ等〔2〕,这些基因决定根瘤菌能与哪些种属豆科植物结瘤〔3〕。根瘤菌的结瘤呈寄主专一性,例如苜蓿中华根瘤菌的寄主范围很窄,仅能在苜蓿、草木樨和葫芦巴3个属的豆科植物结瘤〔4〕。但在1995年。本实验室从新疆苜蓿分离到一株菌株042B,既能在大豆又能在苜蓿上结瘤．而且在大豆上具有较高的共生效率〔5〕。本文拟克隆其nodABC,并与其他菌株nodABC序列进行比较,以阐明042B能在大豆和苜蓿结瘤的分子机制。     

真菌生物碱的研究I．产生生物碱的真菌的筛选

用生物碱沉淀试剂预试、薄层层析确试的生物碱筛选方法,对青藏高原土壤中分离的624株低等真菌的发酵液和真菌组织提取物中存在的生物碱进行了筛选研究。所得结果表明：有114株或18．3％的真菌显生物碱阳性反应。40株生物碱阳性反应较强的真菌包括有青霉。曲霉、镰刀菌、匍柄毒、腐质霉和毛毒属等。除圆弧青霉、顶青毒、淡紫青霉、焦曲霉、黑曲霉,黄曲霉、烟曲霉、构巢曲毒等已有报道外,点青霉、两形青霉、真青霉、荨麻青霉、黑青霉、燕麦镰刀菌、拟直孢镰刀菌、木贼镰刀菌、拟丝孢镰刀菌、弯角镰刀菌、匍柄霉及腐质霉等,均尚未见．有报道。     

固氮菌Klebsiella variicola GN02基因序列及其分泌胞外多糖的相关特性

【背景】一些固氮菌能分泌胞外多糖,与宿主植物的关系密切,在提供氮素和促进植物生长有重要作用。【目的】进行固氮菌Klebsiella variicola GN02的基因序列分析,了解分泌胞外多糖的相关基因和其蛋白的结构特性。【方法】用二代和三代测序技术相结合的方法对GN02菌株进行全基因组分析,并对其分泌的胞外多糖进行理化、结构特性解析。【结果】GN02菌株基因组中含有许多与氮代谢及多糖合成、分泌相关的基因及蛋白,该菌株培养后提取的胞外多糖得率为6.90g/L、分子量1.8×10³Da、比旋度[α]_D²⁵75°、粘度[η]80.28;多糖组成为葡萄糖、半乳糖和甘露糖,为(1→3)及(1→6)糖苷键连接的β构型多糖,具有多糖的红外光谱特征吸收峰。【结论】提供了K.variicola GN02菌株基因组序列,解析了分泌胞外多糖的基因相关蛋白、理化性质及结构特性,有助于进一步了解该固氮菌分泌多糖的机理及为植物促生作用的相关性研究提供基础。     

Cyclin B1蛋白在血管瘤组织中的表达

目的　检测CyclinB1蛋白在皮肤血管瘤组织中的表达 ,探讨CyclinB1在血管瘤发生、发展中的作用及意义。方法　采用免疫组织化学S P法检测增生期血管瘤、退化期血管瘤及正常皮肤组织 (各 2 0例 )中CyclinB1蛋白的表达。结果　在增生期血管瘤、退化期血管瘤和正常皮肤组组织中 ,CyclinB1蛋白免疫组织化学阳性反应颗粒的平均光密度分别为 :0 14 6± 0 0 16 ,0 0 79± 0 0 18,0 0 6 8± 0 0 2 1;阳性面积率分别为 :0 5 38± 0 0 6 5 ,0 2 0 4± 0 0 79,0 176±0 0 5 4。增生期血管瘤与退化期血管瘤、正常皮肤组分别相比 ,CyclinB1蛋白阳性表达的平均光密度和阳性面积率均有极显著性差异 (P <0 0 0 1) ,退化期血管瘤与正常皮肤组之间 ,CyclinB1蛋白阳性表达的差异无显著性 (P >0 0 5 )。结论　Cy clinB1蛋白在血管瘤发生发展和毛细血管内皮细胞的异常过度增生中起着重要的作用。     

利用Tn5-1063转座诱变法分离苜蓿中华根瘤菌042BM noeB基因的研究

采用三亲本杂交方法将带有Tn5-1063(含luxAB)的质粒pRL1063a导入苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meldoti)042BM,进行转座子插入诱变,在含有氯霉素、卡那霉素的TY平板上筛选接合子。通过结瘤试验,从1000个突变株中,筛选到3个结瘤突变株042BMR5、042BMR11和042BRM29。它们都表现出发光酶活性,表明转座子正向插入到基因组中的某个启动子下游。Southern杂交结果证实,转座子均为单一位点插入。对042BMR5突变株基因组进行反向PCR,扩增位于Tn5-1063两端的侧翼序列。测序结果表明,转座子插入到苜蓿中华根瘤菌的共生质粒pSymA noeB基因内。根据基因组中noeB上游和下游序列扩增出042BM noeB,其与苜蓿中华根瘤菌1021 noeB的同源性为98％,而与NoeB蛋白的氨基酸序列相似性为95％。疏水性分析发现,NoeB是一个跨膜蛋白,在N末端有4个跨膜区,其中包含3个初级螺旋和1个次级螺旋。     

细胞周期素G1和G2在膀胱癌中的表达及临床意义

目的探讨细胞周期素G1和G2在膀胱移行细胞癌（尿路上皮癌）中的表达及临床意义。方法收集武汉大学人民医院病理科2000-2006年有完整临床和病理资料的膀胱移行细胞癌存档蜡块50例和5例癌旁组织,采用免疫组织化学S-P法检测50例膀胱移行细胞癌和5例癌旁组织中细胞周期素G1和G2的表达水平。采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告管理系统,对细胞周期素G1和G2的表达进行定量分析,并用SPSS11.5软件对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率做单因素方差分析和SNK（q）检验。结果细胞周期素G1在膀胱移行细胞癌中呈高表达,癌旁组织中呈低表达。而细胞周期素G2在膀胱移行细胞癌中呈低表达,癌旁组织中呈高表达。膀胱移行细胞癌与癌旁组织相比,差异有显著性（P〈0.05）。随着移行细胞癌组织中细胞周期素G1表达的增高,周期素G2的表达却显著下降,两者呈显著负相关（P〈0.01）。结论细胞周期素G1和G2在膀胱移行细胞癌与癌旁组织中对细胞周期调控和/或DNA修复起了重要作用,并参与了诱导细胞凋亡的过程。