杂合抗菌肽CecA_mil的改造及在毕赤酵母中的分泌表达

参照毕赤氏巴斯德酵母（Pichia pastoris）偏好密码子,改造并化学合成杂合抗菌肽CecA_mil基因,改造后的CecA_mil基因克隆到pPICZα_A载体中,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα_A_CM,转化Pichia pastoris受体菌X_33。在醇氧化酶(AOX)启动子调控下,分子量约1.9 kD的CecA_mil杂合抗菌肽获得表达,经表达条件优化,重组酵母菌的摇瓶发酵产率可达到245μg/mL。抗菌特性研究表明,该表达产物具有广谱抗菌活性,对多数G－菌及G＋菌均有较好的抑菌活性,特别是对氨苄青霉素抗性菌和卡那霉素抗性菌抑杀效果更好;具有热稳定性和酸稳定性。这些特点使得重组抗菌肽CecA_mil在食品防腐、疾病防治和动物饲料添加剂等方面显露出很好的应用前景。     

犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定

以伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的犬外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆扩增出犬α干扰素基因,将所扩增基因克隆于原核表达载体pBV220并进行测序,结果显示该基因与GenBank上所公布的犬α干扰素基因同源性为100%.将重组表达载体转入宿主菌进行温敏诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,证明目的蛋白以包涵体的形式存在,大小约为19kDa.将表达产物变性、复性、透析、纯化处理后加入犬肾细胞上,用水泡性口炎病毒攻毒,测出重组的CaIFN-α具有较高的抗病毒作用,生物活性达到5.11×10 6∪/㎎,重组蛋白质的含量约为13㎎/L.     

猪流行性腹泻病毒嵌套式RT-PCR检测方法的建立

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的一种以呕吐、腹泻和失水为特征的猪肠道传染病.各种年龄的猪都可发病[1],哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率最高可达100%,尤其哺乳仔猪的受害最严重.本病在欧洲许多国家均有报道.上海畜牧兽医研究所等单位证实,我国近年来发生的仔猪腹泻,有很多为PEDV引起.     

鸡马立克氏病病毒糖蛋白gB基因的表达及基因免疫

将马立克氏病病毒(Marek's disease virus,MDV)gB基因插入真核表达载体pcDNA3中,经酶切和PCR鉴定为正向插入了gB基因的重组质粒,命名为pcDNA3-gB。体外转染COS-7细胞,经间接免疫荧光染色证实转染pcDNA3-gB后的COS-7细胞内有糖蛋白B的表达。用pcDNA3-gB对从肉用雏鸡腿部肌肉注射,进行一免。间隔2周后,用pcDNA3-gB再加强免疫一次。之后2周攻毒,观察免疫保护效果。结果表明,MDV gB基因DNA免疫可以诱导鸡体产生免疫保护,免疫保护指数为72．2％。     

猪β-干扰素的原核表达及其对猪流行性腹泻病毒的抑制作用研究

本研究通过PCR技术克隆了猪β干扰素全基因,设计引物亚克隆猪β干扰素成熟蛋白编码基因并对,5'端1个稀有密码子进行了大肠杆菌偏嗜性改造.构建了猪IFN-β原核单纯表达载体pRLC-poIFNβ,实现了poIFN-β在大肠杆菌中的表达,表达产物约占菌体总蛋白的17.3%.表达产物以包涵体形式存在,用含6mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSH-GSSG复性液复性处理,复性后的表达产物经凝胶层析纯化后,MDBK细胞-VSV病变抑制法测定结果表明,重组猪β干扰素具有良好的抗病毒活性,约为5.6x105U/mg.用重组猪β干扰素处理猪肾传代细胞PK-15后,细胞病变抑制法(CPE50)测定结果表明重组猪β干扰素可显著抑制猪流行性腹泻病毒(PEDV)的感染.     

共表达猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒NJ-a株ORF4、ORF5与ORF6基因重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建

为探讨共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinerep roductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV)保护性抗原基因的重组改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Virus Ankala,MVA)的免疫效力,将PRRSVNJ-a株ORF4、ORF5和ORF6基因插入转移载体pⅡLR中,获得了三基因共表达的转移载体pⅡLR-ORF5/ORF6/ORF4,通过同源重组的方法获得重组病毒rMVA-GP5/M/GP4。以lacZ为报告基因进行噬斑筛选和重组病毒纯化后,PCR方法证明ORF4、ORF5和ORF6成功的插入MVA基因组中;经Western blot检测与间接免疫荧光试验证实,重组病毒感染细胞能正确表达PRRSVGP4、GP5与M蛋白。用rMVA-GP5/M/GP4免疫6周龄Babl/C小鼠,首免后3周可检测到特异性PRRSV中和抗体,8周后中和抗体效价可达25,并能继续维持4周;淋巴细胞增殖试验结果表明,重组病毒免疫小鼠产生强烈的特异性细胞增殖反应。上述研究结果表明rMVA-GP5/M/GP4具有良好的免疫原性,可作为预防PRRS的候选疫苗进一步研究。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与免疫试验

本研究构建了编码ILTV主要抗原gB基因的重组DNA疫苗pcDNA-gB,质粒转染293-T细胞的间接免疫表明其表达的蛋白具有免疫反应性。为测定该DNA疫苗的免疫效果,将其与本室保存的重组鸡痘病毒rFPV-gB-gD-IgY分别以单独和混合的方式给4周龄非免疫鸡进行免疫,然后测定ILTV特异性抗体和T淋巴细胞增殖反应。结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答。其中以pcDNA-gB/rFPV-gB-gD-IgY联合免疫组的效果最好,其诱导的抗体水平已接近于常规弱毒疫苗,而细胞免疫水平则比后者高得多。上述研究结果为ILTV新型疫苗的研究奠定了基础。     

表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒的构建及特性

提取马立克氏病毒Ⅰ型疫苗毒株CVI988的总DNA为模板,利用PCR技术扩增出病毒生长非必需的US2基因并克隆入T—easy载体。将CMV启动子和增强子控制的含GFP基因表达盒克隆入US2基因中,成功构建了含GFP基因的转移质粒载体pGUS2GFP。用脂质体将其与CVI988株共转染CEF细胞,用96孔板稀释法得到纯化的表达绿色荧光蛋白的重组CVI988病毒株rCVIGFP,并分别测定其在体内和体外的生长情况。表达EGFP基因的重组病毒在细胞上生长曲线与亲本毒CVI988类似,体外实验表明,1日龄腹腔接种该重组毒后,可以从鸡体内分离到表达绿色荧光的病毒。     

传染性支气管炎病毒江苏分离株 核蛋白基因序列测定与同源性分析

将本室鸡传染性支气管炎病毒（IBV）江苏省地方分离肾型毒株JS/95/03接种鸡胚,分离、纯化病毒,提取单股RNA做为反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的扩增模板。用Genbank公开序列多重比较后设计一对引物,使用单管RT-PCR方法,特异扩增IBV核蛋白（N）基因5'端854 bp的片段。扩增产物纯化后测序,序列分析表明,IBVN基因也存在较大变异,此毒株与呼吸型疫苗株M41序列同源性最高。     

鸡γ干扰素成熟蛋白基因的表达及其产物抗病毒活性测定

以血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆出鸡γ干扰素成熟蛋白的基因,把它与非融合表达载体pRLC相重组.通过对阳性宿主菌的不同时间的诱导摸索出最佳表达时间.把表达产物进行变性,复性,纯化后加入鸡胚成纤维细胞上,用水疱性口炎病毒进行攻毒,测出鸡重组γ干扰素的活性单位为1.0×106U/mL,获得了满意结果.