猪瘟病毒E2蛋白A／D抗原区基因在酵母中的分泌表达与鉴定

基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位-B／C抗原区和A／D抗原区,设计一对特异性的引物扩增猪瘟病毒E2蛋白的A／D抗原区基因,并将PCR产物克隆入含有强启动子PAOX1和α-MF信号肽序列的巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZαC中,构建成重组质粒pPICZα-AD,酶切线性化后电穿孔导入巴斯德毕赤酵母X33菌中,经Zeocin^TM筛选得到5株高拷贝转化子,甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blot试验表明酵母培养上清液中含有具有良好反应原性的E2蛋白,蛋白表达量达175．8μg／mL。N-糖基化分析显示该表达蛋白在分泌过程中发生糖基化。该研究为研制防治猪瘟的亚单位疫苗与诊断试剂盒奠定基础。     

利用RNA干扰机制抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的增殖

本文探讨依靠RNAi技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV) 增殖的干扰作用.筛选到针对编码PRRS病毒核衣壳蛋白的N基因的两处靶序列作为候选片段,在MARC-145细胞上进行基因干扰实验研究.成功观测到由载体表达的小干扰RNA (siRNA)在MARC-145细胞中对PRRS病毒增殖的抑制现象.通过选取不同时间段对病毒进行TCID50检测,以及对CPE出现时间进行观察和免疫荧光技术,得到RNA干扰对PRRS病毒增殖抑制作用的动态数据.证实在真核细胞水平上,RNA干扰机制可以抑制PRRS病毒的增殖.实验结果表明,依靠载体表达的RNA干扰技术将会对今后针对PRRS病毒的新型疫苗开发提供一个新思路.     

检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的重组N蛋白一乳胶凝集试验的建立

猪繁殖与呼吸综合征(Poreine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)于1987年首先在美国被发现,现在已经成为危害世界养猪业发展的重要传染病之一.我国已在许多地区分离到该病的病原体-猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome viruS,PRRSV),从而证实了该病在我国的流行[1～4].这些年来,本病的临诊表现及流行病学也出现了新的变化,如隐性感染及慢性感染病例显著上升,持续性感染在猪群中较为普遍.由于本病同其它引起猪繁殖障碍的疾病(如猪细小病毒病、伪狂犬病等)表现出极为相似的临床症状,并伴随混合感染和继发感染[5]增加了临床诊断的难度.所以,探索一种简便易行具有推广意义的检测方法成为本研究的方向.     

传染性法氏囊病病毒VP2基因的真核表达载体的构建及表达

根据GenBank发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV) 5 2 70株VP2 基因序列 ,设计合成了 1对特异扩增IBDVVP₂ 基因的引物。以IBDV超强毒河南分离株HN0 1感染发病鸡法氏囊组织中提取病毒RNA来制模板 ,利用RT PCR扩增出了 1 .4kb的VP₂ 基因 ,将其克隆到pIREShyg载体上 ,构建了pIRES VP₂ 真核表达载体。然后通过磷酸钙共沉淀法转染CHO细胞 ,通过潮霉素筛选得到阳性克隆 ,间接免疫荧光实验 (IFA)鉴定VP₂ 在CHO细胞中的表达 ,并用RT PCR的方法从转录水平证实VP₂ 在CHO k1细胞中的表达 ,最终建立了CHO VP₂ 细胞株 株。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立

根据GenBank公布的H5N1亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,用PCR方法扩增H5N1亚型禽流感病毒HA1基因, 将该片段定向插入到原核表达载体pET_32a(+)中,构建原核表达载体pET_HA1。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3), 经IPTG诱导, HA1基因获得表达, 重组蛋白以包涵体的形式存在。通过改变IPTG的浓度和诱导时间 , 确定了表达HA1基因的最佳诱导条件: IPTG终浓度为0.8mmol/L,诱导时间为3h。Western blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性。以纯化的表达产物作为诊断抗原建立了检测H5亚型AIV抗体的iHA_ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为4μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶200, 阳性标准初步定为：OD待检血清＞05,且 OD待检血清/OD阴性血清＞2。     

非缺陷性网状内皮组织增生病毒的血清学区别

26株来自各种禽的网状内皮组织增生病毒(REV),用多克隆的抗REV鸡血清做交叉中和试验,用REV、T株,Coo1株所制备的单克隆抗体做免疫荧光试验,比较这些毒株之间的抗原关系,从交叉中和试验结果看,它们之间的抗原关系十分接近,可以认为同属于单一血清型;但也确实存在微小差异,因此又可以将它们分为三个血清亚型,这一结果巳被单克隆抗体检验所证实。     

IBV青岛腺胃分离株(SD/97/02)S1蛋白基因的序列测定和分析

参考Genbank上发表的IBV S1纤突蛋白基因序列,设计了一对引物,对鸡传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株(SD/97/02)RNA进行RT-PCR扩增.将PCR产物克隆入pMD18-T载体中进行序列测定和分析.序列分析表明,该毒株的S1基因的G+C%含量较少,为37.0%,存在HindⅢ,BamHI,BgIII,SacI和SalI位点,无EcoRI位点,与其他毒株的同源性在87.02%-94.21%之间,在第154～429nt处为高度的变异区;将基因序列翻译成氨基酸后,假定的S1蛋白由540个氨基酸组成,等电点8.24,在蛋白质内部存在18个Cys,在S1与S2蛋白之间的剪切位点为HRRRR,这与大多数IBV毒株(RRF/SRR)不一样,有三个区域的氨基酸序列高度保守;169～181aa,230～250aa,485～506aa;与其他毒株进行抗原性比较后发现,在该毒株的320～326aa及390～401aa处的抗原表位消失,而在325～345aa、379～389aa处则出现了很强的抗原表位;第438～444aa处,其他IBV毒株(除ZJ971株外)原来存在的强抗原位点在本毒株中消失;在53～65位的氨基酸抗原性与其他毒株相比明显变弱.     

一株貂肠炎病毒某些特性的研究

采用猫肾传代细胞FK增殖华东地区分离的貂传染性肠炎病毒(mink infectious enteritis virus,MEV-S_1)能产生明显的细胞病变。浓缩的病毒液经Sepharose-4B柱层析提纯处理后置电镜下观察,可见典型的病毒粒子。经蛋白酶K、SDS裂解病毒,用苯酚-氯仿法抽提病毒核酸,二苯胺试验和酶消化试验表明该病毒核酸为DNA类型。吖啶橙染色试验表明该DNA为单链。甲酰胺法进行核酸分子展层,病毒核酸呈线状,长度为1.5～2.0/μm。     

马立克氏病血清I型致瘤株病毒感染的早期检测

马立克氏病 (MD)是养禽业最重要的疫病之一 ,一直缺少有效的早期诊断方法。根据血清I型马立克氏病毒(MDV1)meq基因的核酸序列设计了一对寡苷酸核引物 ,分别对MDV1致瘤株 (京 - 1株 )、非致瘤株 (MD11/ 75C株、CV1988株 )、MDV2 (SB 1株 )、HVT(Fc 12 6株 )的核酸进行扩增。结果表明 :京 - 1株扩增到约 1 15kb核酸片段 ,MD11/ 75C株和CVI988株扩增到约 1 0kb核酸片段 ,而SB 1株、Fc 12 6株没得到任何扩增产物。PCR产物Dotblot结果显示 ,京 - 1株、MD11/ 75C株和CVI988株的扩增产物都与Digoxigenin标记的meq基因探针杂交 ,说明都是特异性的扩增产物。对MSB1细胞DNA及MDV感染鸡的血液及肝、肾肿瘤等DNA扩增都得到 1 15kb条带。将京 - 1株和CVI988株感染的细胞DNA混合再扩增 ,同时得到 1 15kb和 1 0kb的核酸条带 ,所以根据扩增产物大小可以区别致瘤株京 - 1株及非致瘤株CV1988株 ,这表示可从CVI988株病毒免疫鸡体内检测到MDV强毒 ,适于早期确诊强毒感染。     

鸭瘟病毒gB蛋白N端主要抗原域的表达及间接ELISA检测

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因.将克隆的基因定向插入pET-32a的EcoR Ⅰ和HindⅢ之间,构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1.将pET-gB1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了DPV gB蛋白主要抗原域的高效表达.免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性.应用His·Bind亲和层析柱纯化重组DPV gB蛋白,以纯化的重组gB1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA.结果表明,抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490＞0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2.应用igB1-ELISA对鸭血清样品进行检测,结果表明igB1-ELISA与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%.