XBP-1转录激活系统的构建

人X盒结合蛋白1(XBP-1)是CREB／ATF(cAMP应答元件结合蛋白／激活转录因子)转录因子家族中的一员,在很多癌细胞中高水平表达。将XBP-1两种剪切形式的编码序列分别克隆在pRC-lac真核载体上,构建成pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U重组质粒。Westem印迹分析表明,这两种XBP-1形式在哺乳动物细胞中都得到了表达。瞬时转染人胚胎肾细胞293T,用荧光素酶报告基因检测这两种剪切形式的转录活性。结果显示,pRC-lac-XBP-1S和pRC-lac-XBP-1U在293T细胞中均有活性,pRC-lac-XBP-1U的活性约是空载体的65倍,pRC-lac-XBP-IS的活性约是空载体的3倍。成功构建了xBP-1的转录激活系统,为进一步了解XBp-1在各种疾病中的作用奠定了基础。     

SRAP、ISSR技术的优化及在甘蓝类植物种子鉴别中的应用

将SRAP与ISSR 2种分子标记技术应用于8种甘蓝类植物（Brassica oleracea L.）的种子鉴别中。先以甘蓝（Brassica oleracea var. capitata）基因组DNA为模板,通过对SRAP、ISSR反应体系中各影响因素的逐一筛选,优化了甘蓝类植物SRAP、ISSR反应体系。进而采用30个SRAP引物组合和15个ISSR引物对白甘蓝、皱叶甘蓝、红甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、青花菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝的基因组DNA进行了PCR扩增,结果表明：M3E5与M4E5两个SRAP引物组合可以在8种甘蓝类植物之间显示较高的多态性;844和888两个ISSR引物也可在8种甘蓝类植物之间产生很好的多态,特别是844引物单独应用即可区分所有材料。     

在小鼠胚胎干细胞进行基因打靶的策略

基因打靶技术是一种通过同源重组按预期方式改变生物活体的遗传信息的实验手段,与小鼠胚胎干细胞培养系统相结合,使得人们可以方便地将各种突变引入小鼠体内,得以从生物整体水平上研究高等真核生物基因的表达、调控及其生理功能.扼要介绍了近年来在小鼠胚胎干细胞进行基因打靶的研究进展.     

小鼠胚胎干细胞分化形成拟胚体过程中的细胞程序性死亡

为了检测小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcell ,ES细胞 )体外分化的拟胚体 (embryoidbodies ,EBs)形成过程中细胞程序性死亡 (programmedcelldeath ,PCD)的发生 ,通过悬滴、悬浮培养技术定向诱导未分化的ES细胞分化为拟胚体 ,并用RT PCR检测原始内胚层、原始外胚层、中胚层、内脏内胚层 4种分子标记物在EBs中的表达 .通过TUNEL染色、电镜、激光共聚焦显微镜及Western印迹以确定凋亡发生 .结果表明 :ES细胞体外分化为拟胚体并且表达各胚层相应的分子标记物 ;在拟胚体的发育过程中出现明显的空腔化过程 ,TUNEL染色及电镜观察到凋亡生成 ,同时线粒体膜电位 (ΔΨm)在拟胚体发育过程中降低 ,通过Western印迹检测到caspase3、caspase8的激活 .表明小鼠ES细胞所分化的拟胚体可以作为研究早期胚胎发育的实验模型 ,线粒体在拟胚体的细胞程序性死亡过程中发挥重要的作用 .为进一步利用拟胚体研究细胞程序性死亡及相关信号分子在小鼠胚胎发育早期的作用奠定了基础     

胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的建立及鉴定

组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性基因剔除研究的重要工具。为了建立胰腺组织特异性Cre转基因小鼠,我们通过PCR克隆了大鼠胰岛素基因启动子,并用它指导Cre基因在胰岛细胞中的特异性表达。在Cre重组酶基因5′端添加了真核核糖体结合序列和核定位序列以使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核中发挥功能;同时,在Cre基因3′端添加了含内含子的3′端人生长激素基因。表达载体经显微注射导入小鼠受精卵以建立转基因小鼠。PCR检测显示共获得7只Cre整合阳性的转基因首建者小鼠;RTPCR结果表明其中1只首建者小鼠的子代鼠在胰腺中转录了外源基因,进一步的Southern杂交结果表明,该转基因小鼠能够在胰腺中表达有功能的Cre重组酶。      

固化河岸对长江江豚栖息活动的影响

长江江豚主要栖居在近岸浅水水域,喜好泥沙质类型的河岸。但在长江干流,有很多自然河岸被固化,河岸固化给长江江豚分布和栖息活动造的影响仍不甚清楚。2016年3月—2017年1月,对长江干流2个自然河段江豚的数量和分布做了12次考察,并收集了这2个河段岸型的相关数据,来分析固化河岸对江豚栖息活动的影响。12次考察累计发现江豚215头次,平均每次考察观察到江豚(17.92±7.09)头次。研究区域的固化河岸约占岸线总长的59%,分析发现,仅约13.9%的江豚分布在固化河岸水域,86.1%的江豚均分布在自然河岸水域。江豚在单位河岸长度的分布数量与该段固化河岸长度所占的比例呈显著负相关(r=-0.639,P0.01)。在自然河岸,分布在近岸50 m水域的江豚占31.8%,而在固化河岸,仅观察到2头江豚活动在近岸50 m水域内。由此可见,固化河岸对江豚的近岸分布有明显影响。调查还发现,安庆城区建设带约10 km江段12次考察均未发现江豚分布,城区建设带可能对江豚栖息已造成严重影响。长江干流的固化河岸所占比例非常高,研究结果提示这可能导致长江干流江豚栖息地的丧失和破碎化加剧,在制定长江江豚保护措施必需慎重考虑此因素的影响,并据此提出相应的栖息地保护和恢复方案。     

牛β-乳球蛋白基因的克隆及其调控外源基因表达的研究

目的制备乳腺生物反应器所必需的乳腺特异性表达的调控序列,并验证其指导外源基因表达的能力.方法用PCR法从奶牛染色体上分5段扩增出了全长8.2Kb的牛β-乳球蛋白基因,包括1.8Kb的5′侧翼区、1.7Kb的3′侧翼区及4.7Kb的gDNA区.扩增出的各片段克隆到T-载体上,酶切鉴定及序列分析均证实了所扩增片段的正确性.将五个片段与荧光素酶cDNA拼接成荧光素酶瞬时表达载体并在小鼠乳腺中瞬时表达.结果注射荧光素酶瞬时表达载体的小鼠乳汁中明显测出了荧光素酶活性.结论所克隆的牛β-乳球蛋白基因表达调控序列能够指导外源基因在小鼠乳腺中表达.     

p16在HBsAg和HBx转基因小鼠肝脏肿瘤中的表达

目的:探讨p16基因在由乙型肝炎病毒基因整合引起的小鼠肝细胞癌发生发展中的表达变化规律。方法:以乙肝病毒表面抗原基因(HBsAg)及X基因(HBx)定位整合转基因小鼠及对照小鼠的肝脏组织为标本,利用North-ern印迹、Western印迹及免疫组织化学检测p16在乙肝病毒基因定位整合转基因小鼠肝脏正常组织与肿瘤组织中的差异表达。结果:p16主要在小鼠胚胎期的肝脏中表达,在新生小鼠和成年小鼠的肝脏组织中几乎检测不到其表达;在HBsAg转基因小鼠和HBx转基因小鼠的肝脏肿瘤中,p16的表达明显升高。结论:p16基因在HBsAg或HBx诱导的肝细胞癌发生过程中被重新激活,也许发挥重要的作用。     

利用寡核苷酸芯片分析Smad3基因敲除小鼠关节软骨细胞基因表达谱的改变

此前发现 Smad3 基因敲除小鼠(Smad3ex8/ex8)的关节软骨细胞异常肥大分化,出现类似于人类骨关节炎的表型。为了进一步明确转化生长因子-β(TGF-β)/Smad3 信号通过调节哪些靶基因的表达来抑制关节软骨细胞的肥大分化,以及研究骨关节炎发病的分子机制,利用寡核苷酸芯片技术分析了 5 日龄 Smad3 基因敲除小鼠与野生型对照小鼠关节软骨细胞基因表达谱的改变。通过对差异表达基因的分析,发现在 Smad3 基因敲除小鼠软骨细胞中骨形态发生蛋白(BMP)与 TGF-β/细胞分裂周期基因 42(Cdc42)信号通路活性增强。此外,还发现其他信号通路,如生长激素(growth hormone)/胰岛素样生长因子 1(Igf1)以及成纤维细胞生长因子(Fgf)信号通路相关基因表达的改变。值得注意的是,还发现了 Smad3 基因敲除小鼠软骨细胞中蛋白合成与电子传递链相关基因的表达水平普遍上调,这意味着蛋白质合成速率的加快与细胞有氧呼吸的增强可能与关节软骨细胞的肥大分化和骨关节炎的发生相关。     

特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的方法

利用组织特异性分子标志物启动子调控Cre重组酶,研制了6种在不同组织中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠.这些转基因小鼠的基因型鉴定均使用设计在Cre基因编码区的通用引物.为了特异性检测胰腺组织表达Cre重组酶的转基因小鼠,在大鼠胰岛素RIP启动子上和Cre基因上设计1对引物进行PCR扩增,并通过凝胶电泳进行分析.PCR结果显示,设计在Cre基因上的通用引物可以从6种不同组织特异性Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增获得480 bp产物;利用本研究设计的特异性引物可以从胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠基因组DNA中扩增200 bp的目的条带.这一结果表明,利用特异性引物进行PCR反应,可有效地将胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠与其他多种组织的Cm重组酶转基因小鼠鉴别开来.