云南省昆明地区番茄斑萎病毒核衣壳蛋白和运动蛋白变异分析

为了明确对番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)免疫的番茄YNAU335自交系表现出TSWV感病症状(抗性被打破)的原因,在排除YNAU335自交系不纯和或混杂其它感病番茄材料的因素外,选取96172I(感病)和YNAU335(抗性被打破)自交系感病植株,进行TSWV核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,NP)和运动蛋白(movement protein,MP)基因的RT-PCR检测,并对阳性克隆进行基因测序分析。结果表明:(1)2个自交系中均克隆出TSWV的NP和MP基因,共获得5条NP(登录号:MK628735～MK628739)和3条MP(登录号:MK883723、MK883724和MK887284)多态性基因序列。(2)96172I感病材料中克隆出以上所有基因序列,YNAU335感病材料中克隆出其中的3条NP和1条MP基因序列。(3)对YNAU335中TSWV特有的NP和MP氨基酸突变位点进行分析,结果发现4个特异突变位点可能与打破YNAU335抗性有关,4个突变位点分别为:NP 18位氨基酸G突变为V,36位T突变为I,39位L突变为R,MP 274位E突变为K。(4)系统发育分析显示,5条NP和3条MP与云南省已登记的NP和MP聚类在不同的分支,表明云南省昆明地区TSWV存在丰富的遗传多样性。     

9-顺式维甲酸在原代培养猪前体脂肪细胞分化中的调控作用

采用RT-PCR、油红O染色法、油红O染色提取法和分光光度计法,探讨不同浓度9-顺式维甲酸(9-cisRA)(0-10$mol/L)对体外原代培养猪前体脂肪细胞分化的影响及其可能机制。结果表明,9-cisRA在脂肪细胞分化中因浓度不同而发挥不同作用。低浓度9-cisRA(0-10nmol/L)促进前体脂肪细胞分化,并上调RXRα、PPARγmRNA表达,增加前体脂肪细胞分化标志酶3-磷酸甘油脱氢酶(glyc-erol-3-phosphate dehydrogenase,GPDH)的活性;高浓度9-cisRA(100nmol/L-10$mol/L)则抑制前体脂肪细胞分化,并下调RXRα、PPARγmRNA表达,减少GPDH的活性。结果提示9-cisRA在猪前体脂肪细胞分化中,可能通过调控RXRα和PPARγ基因表达变化来发挥其促进或抑制作用。     

一种快速、高效的橡胶树胶乳总RNA 提取方法

胶乳是橡胶树(Hevea brasiliensis)乳管中特殊的细胞质, 主要由橡胶粒子、黄色体、F-W粒子和普通细胞质成分构成, 其中橡胶粒子占20%-40%, 蛋白含量高达1%-2%。由于高比例橡胶粒子和蛋白质的干扰, 目前使用的胶乳RNA提取方 法都具有步骤繁琐、胶乳需求量大、操作技巧性强不易掌握等缺点。为快速、高效地获取高质量的胶乳RNA, 我们在现有方法的基础上摸索出一套步骤简单、容易操作、快速、高效提取橡胶树胶乳总RNA的简易方法, 获得了较好的实验效果。紫外分光光度计、RT-PCR和RACE分析结果表明, 使用该方法提取的胶乳RNA质量完全能够满足相应的分子操作, 但所需时间仅为目前常用方法的50%, RNA获得率提高了2-3倍, 操作难度大大降低。     

转录因子Snail与胆道癌发生发展的关系

胆道癌是常见的消化道恶性肿瘤,发病较隐匿,早期常无明显临床症状及体征,恶性程度高,转移早,一经临床确诊多为中晚期,手术切除率低,预后差。目前,虽然有关胆道肿瘤相关分子生物学的研究很多,但尚未取得实质性进展。Snail转录抑制因子对生物胚胎的发育和细胞的分化具有重要作用,尤其在上皮细胞正常分化和增殖过程中起关键作用。相关研究表明Snail与消化道肿瘤发生发展有一定相关性。本文拟就国内外有关转录因子snail与胆道癌发生发展的相互关系的研究作一综述,旨在为胆道癌的临床诊治方案的选择和预后评估提供参考依据。     

141例小儿感染性腹泻临床特征及流行病学分析

目的:探讨儿童感染性腹泻(Infectious diarrhea,ID)的临床特征及病原菌学流行病特点,为临床防治提供理论依据。方法:回顾性分析我院2010年2月至2014年2月收治并确诊的141例感染性腹泻患儿的粪便培养结果,观察并总结患者体内大肠埃希菌、痢疾杆菌、肺炎克雷伯菌病毒等常见致病细菌的分布情况。结果:儿童感染性腹泻四季均可发病,夏季发病率最高,春季最低;年龄为1月~3岁的患儿感染性腹泻细菌及病毒感染比例显著高于其他两组(P0.05);141例患儿中,细菌阳性23例(16.3%),病毒培养阳性94例(66.7%)。各种病毒感染与患儿性别无关(P0.05)。结论:小儿感染性腹泻四季均较常见,病毒感染比例高于细菌感染比例,应根据病原菌分布情况积极采取预防与控制措施。     

腰麻硬膜外联合麻醉与硬膜外麻醉对剖宫产患者血流动力学的影响

目的:探讨腰麻硬膜外联合麻醉与硬膜外麻醉对剖宫产患者血流动力学的影响。方法:选择我院2013年12月至2014年12月收治的80例行剖宫产手术产妇,按随机数字表法平均分为A组及B组各40例,A组产妇使用腰麻硬膜外联合麻醉(CSEA),B组产妇使用硬膜外麻醉(EA),比较两组产妇麻醉效果,血流动力学变化、新生儿Apgar评分及产妇不良反应发生情况。结果:A组产妇麻醉效果Ⅲ级比率85.0%,明显高于B组的22.5%(P0.05)。A组产妇心率(HR)在胎儿娩出10 min(T3)及手术结束(T4)时刻明显高于B组,收缩压(SBP)和舒张压(DBP)在胎儿娩出即刻(T2)明显高于B组,平均动脉压(MAP)在麻醉前(T1)和麻醉后(T4)明显高于B组,每博输出量(SV)在T2时刻明显低于B组,比较差异具有统计学意义(P0.05);两组产妇心输出量(CO)各时刻比较差异无统计学意义(P0.05)。A组新生儿在娩出1 min时Apgar评分明显高于B组(P0.05)。A组不良反应发生率为5.0%,B组产妇不良反应发生率为10.0%,两组比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:对剖宫产手术患者使用CSEA麻醉效果明显优于EA,且患者血流动力学更为稳定,麻醉效果较完善,安全性高,可应作为剖宫产手术首选的麻醉方式。     

解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体的构建

目的:构建解偶联蛋白UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,为寻找调控UCP1表达的小分子化合物提供有效工具。方法:从小鼠基因组DNA中PCR扩增小鼠UCP1启动子上游2000 bp序列,并将该序列连接到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,构建p GL3-UCP1启动子。测序正确后,提取质粒,然后将上述载体与p RL-TK载体共转染至HEK293细胞、小鼠白色脂肪前体细胞和小鼠棕色脂肪前体细胞,48 h后裂解细胞检测荧光素酶的活性。结果:通过PCR成功扩增获得了目的片段,并将其克隆至p GL3-basic中。与细胞内源UCP1表达水平相似,荧光素酶报告系统表明构建的p GL3-UCP1在棕色脂肪细胞中启动子活性最高,在白色脂肪细胞中活性较低,在HEK293细胞中基本没有活性。同时β3肾上腺素受体激动剂CL 316,243同样能够上调p GL3-UCP1的启动子活性。结论:成功构建了小鼠UCP1启动子荧光素酶报告基因载体,并证明在棕色脂肪细胞中,该启动子具有很强的启动子活性,而在白色脂肪和HEK293细胞中,启动子活性很低。该启动子报告系统有望为寻找激活UCP1的小分子化合物提供重要平台。     

14-3-3θ基因过表达载体的构建及其过表达乳腺癌细胞株的建立

目的:为进一步研究14-3-3θ基因对乳腺癌生物学行为的影响,构建14-3-3θ基因真核细胞过表达重组载体并建立其过表达的乳腺癌细胞株。方法:合成的14-3-3θ基因重组在p ENTR 3C DUAL载体中,课题组采用DNA重组技术将14-3-3θ基因剪切分离后,插入真核表达质粒载体pc DNA4.0中,重组得到真核过表达载体pc DNA4.0-14-3-3θ,并用其转染293T细胞后用western blot进行验证,将经过验证的真核过表达载体pc DNA4.0-14-3-3θ转染乳腺癌细胞后用zeocin筛选,筛选出的乳腺癌细胞经过western-blot和PCR验证确为稳定过表达14-3-3θ的乳腺癌细胞。结果:成功构建14-3-3θ基因过表达真核载体并建立其过表达乳腺癌细胞株,揭示14-3-3θ基因可能在乳腺癌的早期诊断和预后预测中具有重要作用。     

实时荧光定量PCR 法用于重组SIV-hPEDF注射液病毒颗粒数的检测

目的:建立重组SIV-h PEDF注射液病毒颗粒数检测实时定量PCR检测方法。方法:在提取重组SIV-h PEDF注射液供试品基因组RNA后,采用实时定量PCR的方法,检测供试品中的病毒颗粒数。结果:经过3次实验,所得SIV-h PEDF RNA标准品标准曲线均线性良好,重组SIV-h PEDF注射液供试品中病毒颗粒数检测结果无显著性差异。结论:所建立的重组SIV-h PEDF注射液病毒颗粒数实时荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏、准确,可用于重组SIV-h PEDF注射液病毒颗粒数的检测。     

NUCB2/nesfatin-1对小鼠摄食行为的调控及机制

目的:探讨NUCB2/nesfatin-1对小鼠摄食行为的调控及机制。方法:利用侧脑室埋管,免疫组化染色等方法,探讨侧脑室和外周注射nesfatin-1对小鼠摄食行为的影响。结果:侧脑室注射不同剂量nesfatin-1(0.3μg,1μg,3μg),注药后4 h夜间进食量明显减少,且呈显著剂量依赖关系(t=2.61~4.78,P0.05~0.01),侧脑室注射3μg nesfatin-1,小鼠前3小时累积摄食量明显降低(t=8.69~10.73,P0.01),且持续降低12小时(t=2.64,P0.05),同时餐间间隔时间明显延长(t=2.66,P0.05),每分钟/1-4 h进食量明显降低(t=2.63,P0.05),且进食每克食物所用时间明显增加(t=3.02,P0.05)。在下丘脑弓状核,外侧区和背内侧核均有NUCB2/nesfatin-1免疫阳性神经元表达。皮下或腹腔注射nesfatin-1,小鼠进食量和进食行为均无显著改变(P0.05)。结论:中枢nesfatin-1可抑制小鼠摄食行为。