用抑制性差减杂交构建新疆Kaposi肉瘤差异表达基因文库

目的:分离卡波氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma,KS)差异表达基因,并建立相应的cDNA文库,为从分子水平揭示KS发病机制打下良好的基础。方法:采集KS肉瘤及来源于同一患者的正常皮肤组织,抽提总RNA,经逆转录酶合成dscDNA,并经RsaⅠ酶切,与2种不同的接头衔接,分别以正常组织和肿瘤组织作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH),初步筛选KS肉瘤与正常皮肤差异表达基因,将差异基因PCR扩增,产物与pGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5α大肠杆菌,采用蓝白斑筛选,获得白色阳性克隆菌落,并煮沸破菌,PCR扩增出未知基因片段。结果:差减得到差异基因片段多位于200~500bp,成功构建了2个分别代表在KS肿瘤组织中表达上调和下调的基因文库。结论:经双向抑制性差减杂交获得了KS差异表达基因文库。抑制性差减杂交是一种快速、方便、有效的建立差异基因文库的方法。     

多倍体罗汉果PCR-RFLP参数的优化与应用

以多倍体罗汉果DNA为材料,采用L16(4~5)正交组合试验和单因素梯度试验,研究Mg~(2+)、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA浓度和退火温度、循环次数等对PCR扩增结果以及内切酶量、酶切时间对酶切反应的影响。结果表明,多倍体罗汉果RFLP最优PCR反应体系和扩增参数为:在25μL扩增反应体系中,10×Buffer 2.5μL,MgCl_2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.1μmol/L,Taq DNA聚合酶2.0 U,模板DNA 60 ng;退火温度为56℃,循环次数为35次。酶切反应体系:内切酶10×Buffer 2.0μL,内切酶5.0U,PCR产物15μL,超纯水补至20μL;酶切时间2 h。     

云芝免疫调节蛋白TVC的纯化与特性

生物活性蛋白是药用真菌中一类重要的活性功能因子. 云芝是中国传统的药用真菌, 具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等活性. 通过硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析等过程, 从云芝子实体中分离纯化得到一种新的免疫调节蛋白(命名为TVC). TVC在SDS-PAGE结果中呈现分子量为15 kD的单一条带, 而在Native-PAGE结果中表现分子量为30 kD, 表明天然的TVC为同源二聚体. 等电聚焦电泳表明, TVC的等电点pI为4.0, 为酸性蛋白质, 根据periodic acid/Schiff试剂染色反应表明, TVC不含糖, 且对大鼠红细胞没有凝集作用, 表明TVC缺乏凝集素的典型特征. 免疫活性测定, 应用流式细胞仪检测发现TVC能增强小鼠脾淋巴细胞的增殖, 但对CD⁴⁺, CD⁸⁺等T细胞无影响; TVC以剂量依赖的方式对人外周血淋巴细胞有增殖活性, 同时与刀豆蛋白A有联合增殖效应; TVC还能以剂量依赖方式提高脂多糖LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7产生NO和肿瘤坏死因子TNF-α的产量, 表明TVC是一种免疫刺激剂, 能够提高机体的免疫反应. N端测序和蛋白质MALDI-TOF/TOF质谱, 没有在蛋白质数据库中发现同源蛋白质, 说明TVC是一个新的免疫调节蛋白.     

急性肺损伤患者血清高迁移率族蛋白B-1与APACHE Ⅱ的相关性研究

目的:研究急性肺损伤后血清高迁移率蛋白B-1(HMGB-1)的水平变化,并探讨其与APACHEⅡ评分的相关性.方法:测定10例正常成人与40例急性肺损伤病人伤后第1、4、7天的血清HMGB-1水平,同时评定其APACHE Ⅱ分值.在此基础上进行统计学分析,了解HMGB-1水平变化与-APACHEⅡ分值的相关性.结果:以APACHEⅡ20为分组界限,急性肺损伤组伤后第4、7天HMGB-1水平与APACHEⅡ明显相关(P<0.01).而创伤后第1天,HMGB-1水平与APACHEⅡ评分无显著相关性(P>0.05).结论:伤后第4、7天的HMGB-1水平与APACHEⅡ评分显著相关(P<0.01),常规检测创伤后血清HMGB-1水平并联合评定APACHEⅡ评分有助于对创伤后脏器功能不全的预测.     

人工饲养条件下死亡实验恒河猴肠道病理改变特点分析

目的观察人工饲养条件下实验恒河猴肠道病理改变,探讨实验猴肠道疾病分布规律和病理改变特点,丰富实验猴自发病变基本研究资料。方法对1998-2008年云南地区饲养的自然死亡的155只恒河猴（年龄2-20岁）的肠道进行病理检查,按年龄分为幼年组、成年组、老年组,并对观察结果进行统计学分析。结果155例恒河猴中58例检出肠道病变,有慢性肠炎、急性肠炎、黏膜充血水肿、出血、糜烂、溃疡、穿孔、寄生虫共8种主要病变,出现率最高的为急性肠炎（20．00％）。实验猴不同年龄组肠道病变类型分布基本相同,肠道病变率随年龄增长而增高,不同年龄组间统计学分析差异无显著性。结论人工饲养条件下死亡实验猴肠道病变检出率较高,急性肠炎是实验猴的主要致死原因之一,实验猴肠道病理改变随年龄增长而病变加重。对实验猴饲养和研究时,应重视肠道病变因素,尤其是急性肠炎。死亡实验猴肠道病变研究对实验猴的质量控制和相关动物实验有重要指导价值。     

百色六怀山遗址周边新发现的旧石器

六怀山遗址是百色盆地内一处重要的旧石器时代早期遗址, 2008年12月在其周边进行考查时, 新发现旧石器地点3处, 采集石制品37件。石制品类型包括石核、石片、砍砸器、手镐等; 原料主要为石英岩、石英砂岩、粉砂岩等; 石器毛坯主要为砾石, 器型粗大, 具有南方砾石石器工业的鲜明特征。初步分析显示, 新发现地点属同一时段人类活动的结果, 进一步的工作将有助于了解旷野遗址人类行为特点, 丰富中国旧石器时代考古学研究的内涵。     

应用RNA干扰技术体外抑制兔成纤维细胞HGPRT的表达及其核移植研究

次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase,HGPRT)的功能缺失与痛风、肾结石和雷纳综合症(Lesch-Nyhan Syndrome)等疾病相关.制作HGPRT基因表达降低的模式动物,将有利于人们对这种疾病的发病机理和治疗做进一步的研究.构建了针对HGPRT基因表达的shRNA干扰载体,并将质粒转染兔成纤维细胞,获得携带该干扰片段的转基因细胞系,经PCR鉴定转基因成纤维细胞克隆阳性率为83.3%.RT-PCR及Western blot检测结果表明转基因干扰成纤维细胞系HGPRTmRNA和蛋白质表达量明显降低.最后,以转基因成纤维细胞进行核移植,囊胚率为27.8%,与正常来源的成纤维细胞囊胚率相比较差异不显著.说明,通过RNAi可稳定干扰兔成纤维细胞HGPRT基因的表达,为进一步通过核移植技术建立HGPRT RNAi转基因兔模型创造条件.     

吉林省野生杏种质资源遗传多样性研究

遗传多样是生物多样性的核心,决定着生物多样性的其他方面,是在分子层面上揭示生物多样性的本质.近10年来世界上遗传多样性研究方法发展迅速,主要手段是运用基于DNA分子标记方法.采用DNA-RAPD分子标记方法,对吉林省野生杏资源进行了遗传多样性研究.旨在进一步从分子水平上对吉林省野生杏资源的生物多样性进行研究,目的是从理论上证明其资源多样性非常丰富.     

丹江口库区红石坎Ⅰ旧石器地点发掘简报

红石坎Ⅰ旧石器遗址是丹江口库区一处重要遗址,埋藏于汉江右岸第3级阶地。2008年发掘并揭露525m2,出土石制品136件,采集22件。石制品类型包括备料、人工石块、石锤、石核、石片、刮削器、砍砸器、手镐、凹缺刮器、碎片等,具有南、北方石器工业过渡的文化特征,时代应属于旧石器时代早期。     

一种新的PrP无细胞构象转化系统的建立

PrP细胞外构象转化系统已经被一些实验室用于朊病毒的研究,但在反应体系中往往需要使用放射性同位素。为了建立一种安全方便的PrP无细胞构象转化系统用于TSE发病机制的研究,通过PCR方法获得仓鼠PrP(HaPrP)全长基因,克隆至原核表达载体pQE30,在大肠杆菌中表达并纯化出分子量为27kD HaPrP蛋白,Western blot证实可与PrP特异性单克隆抗体反应。将纯化蛋白在体外标记生物素(Biotin-7-NHs),与纯化的scrapie 263K毒株仓鼠感染脑组织PrP^Se蛋白共同孵育4天后,经蛋白酶K消化,Western blot检测,证明存在一条抵抗蛋白酶K消化的、被亲和素特异性识别的条带,其分子量约为20kD。这表明HaPrP^sen可以被转化为HaPrP^res。实验表明,可以利用原核系统取代真核系统表达PrP,并用生物素标记取代^35S标记纯化蛋白,建立一个更加安全方便的无细胞构象转化系统,用于朊病毒的研究。