铜绿假单胞菌PA1550基因对泳动及蹭动的影响

[目的]:研究与铜绿假单胞菌运动能力相关的基因.[方法]:以一株临床分离的铜绿假单胞菌PA68做受体菌,应用人工Mu转座技术建立了库容为2000的突变子文库,从中筛选出泳动能力和蹭动能力丧失或减弱的突变子,通过基因克隆、测序,GenBankBLAST比对测序结果,互补基因表达确定与铜绿假单胞菌运动能力相关的基因.[结果]:突变子Y46在丧失了泳动运动能力的同时,蹭动能力也发生了减弱.在Y46突变子中,Mu转座子插入到功能完全未知的基因PA1550中.对极性效应及PA1550所在操纵子的分析表明,Mu转座子对插入点下游的基因的转录并不造成影响.[结论]:PA1550与铜绿假单胞菌的泳动及蹭动能力有关.     

肺炎克雷伯菌RcsAB蛋白对荚膜多糖相关基因wcaJ、wcaG和magA的调控关系

荚膜多糖(CPS)是肺炎克雷伯菌(Klebssiella pneumoniae)重要的毒力因子.Rcs系统是肠杆菌科(En-terobacteriacese)中重要的双组分信号转导系统,RcsAB是其中主要的转录调控蛋白.本研究选取了肺炎克雷伯菌NTUH-K2044 cps基因簇上的3个基因(wcaJ,wcaG和magA),研究RcsAB对上述3个基因可能存在的调控关系.通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术和LacZ报告基因融合试验来确认RcsAB是否能够调控上述3个基因的转录表达.进而用凝胶阻滞试验(EMSA)验证RcsAB能否直接结合在靶基因的启动子区,对靶基因进行直接调控.结果表明RcsAB能够正向调控上述3个基因的转录表达,EMSA的结果提示RcsAB对这3个基因可能是通过间接的方式进行调控.RcsAB蛋白可能通过间接调控荚膜多糖基因wcaJ、wcaG和magA的转录,从而影响菌株的荚膜多糖表型.     

基因芯片技术探究肺炎克雷伯菌RcsB的转录谱

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)是临床上重要的条件致病菌,主要引起肺炎、泌尿系统疾病、肝脓肿以及菌血症等临床疾病。Rcs B是磷酸信号转导系统中的核心调控子,有证据证明Rcs B可调控部分肠杆菌毒力的表达。本研究利用基因芯片技术筛选出Rcs B调控的靶基因并进行生物信息学分析,同时实时荧光定量PCR技术验证基因芯片结果。通过基因芯片技术共筛选出223个差异基因,其中表达下调基因有132个,表达上调基因有91个。q RT-PCR实验显示,挑选的8个基因的q RT-PCR结果均与芯片结果相符。223个差异基因的COG分析表明Rcs B调控的靶基因主要影响能量的产生和转换,碳、氨基酸的转运和代谢以及细胞壁、外膜的生成等细胞途径。GO富集分析表明Rcs B调控的靶基因主要参与碳水化合物衍生物代谢,酶的催化活性,膜合成等生理生化过程。本研究通过全基因组芯片技术对肺炎克雷伯菌Rcs B的转录谱进行了探究,明确了Rcs B调控的靶基因的相关功能及其调控机制,为通过探究Rcs B的靶基因来进一步深入了解Rcs磷酸信号转导系统对肺炎克雷伯菌毒力的影响奠定了基础。     

节杆菌BT801 N-氨甲酰氨基酸水解酶基因的克隆与表达

通过PCR从质粒pUC18-169中扩增得到N-氨甲酰氨基酸水解酶基因（hyuC）,置于原核表达载体pQE60的T5启动子下游构成表达质粒pQE60-hyuC,并在大肠杆菌M15中实现了该基因的高表达。SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量44kD处有一表达带,经薄层扫描分析目的蛋白占全菌蛋白的40%,主要以可溶性形式存在。酶活性分析结果表明,工程菌M15/pQE60-hyuC的N氨甲酰氨基酸水解酶的比活分别比原始菌株Arthrobacter BT801和亚克隆DH5α/pUC18-169提高了52倍和72倍。在节杆菌BT801和大肠杆菌DH5α/pUC18-169的反应体系中加入等量菌体的工程菌M15/pQE60-hyuC,可使乙内酰脲酶总比活分别提高8.1倍和3.0倍。     

N-氨甲酰基氨基酸水解酶在毕赤酵母中的表达

N-氨甲酰氨基酸水解酶是乙内酰脲酶系的组成部分,催化N-氨甲酰氨基酸水解为相应氨基酸。节杆菌BT801的N-氨甲酰氨基酸水解酶是该菌乙内酰脲酶系中惟一具立体专一性的酶,也是整个反应体系的限速酶。通过PCR从携带乙内酰脲酶系完整操纵子的亚克隆质粒pUC18-169上扩增得到N-氨甲酰氨基酸水解酶基因(hyuC)片段,连接到载体pPIC3.5K上,经BglⅡ酶切线性化,通过PEG法转化导入毕赤酵母GS115感受态细胞,利用G418抗性筛选得到插入多拷贝目的基因的转化子。酶活性分析表明所得转化子具