遗传丰余与酵母后基因组研究

遗传丰余与酵母后基因组研究潘辉李育阳（复旦大学遗传学研究所,上海２００４３３）关键词酿酒酵母遗传丰余后基因组研究酿酒酵母（以下简称酵母）基因组ＤＮＡ全序列测定后,人们从中发现了很多ＤＮＡ重复序列,其中一部分为完全相同的ＤＮＡ序列。如ｒＤＮＡ与ＣＵＰ１...     

基因工程人α心钠素发酵研究

本研究采用的基因工程菌为酵母Y33：：YFD71－3,其基因型为α,his,1eu,ade,suc．摇瓶培养时心钠素的表达水平为l～2rag／L。在含有葡萄糖、YNB以及不同量腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸的YG培养基中作摇瓶培养．当细胞的生长由腺嘌呤限制时,蛋白的分泌有明显增加·在YG培养基中加入5g／L的CAA后腺嘌呤成为限制性基质,培养基中腺嘌呤、YNB和亮氪酸用量对心钠素的表达有很大影响。在5L反应器中进行补料分批培养,流加葡萄糖、YNB、cAA、腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸,心钠素的最高浓度达到24．8mg／L。     

酵母SUC2基因的克隆

本文以酵母一大肠杆菌穿梭质粒YEP51为载体构建了酿酒酵母s.cerevisiae 2．1168的基因文库,并用DNA分子杂交技术从这个基因文库取得了包括suC2基因的克隆YFD6。本文还对YFD6中的SUC2基因在酵母细胞中的表达,YFD6的物理图谱以及SUC2基因在YFD6上的位置作了初步分析。     

用纸片影印法检测酵母蔗糖酶

在基因工程克隆技术中,如何建立灵敏的 筛选方法是研究课题中的一个重要组成部分。 采用平皿培养基检测法进行克隆初筛是一种较 为简便的方法。     

酿酒酵母位点特异性DNA切离及定点整合的研究

酿酒酵母２μ环的ＦＬＰ－ＦＲＴ位点特异性重组系统由ＦＬＰ重组酶和ＦＲＴ重组位点所组成。将ＦＬＰ基因置于受半乳糖调控的酵母ＧＡＬ１０启动子控制下,在半乳糖诱导下实现了酿酒酵母染色体上两个顺向排列ＦＲＴ位点之间ＤＮＡ序列的切离;并将一个含有ＦＲＴ重组位点的环状质粒整合到酿酒酵母染色体上预先设置的一个ＦＲＴ重组位点上,实现了染色体定点整合。这个由ＦＬＰ重组酶催化的位点特异性重组过程具有重组效率高和重组位     

乙型肝炎病毒表面抗原在乳酸克鲁维酵母中的表达

将乙型肝炎表面抗原基因插入具调控型启动子PH05的乳酸克鲁维酵母表达载体中,构建完成质粒pLSl．转化宿主菌Kluyveromyces lactis CXJ1—7A,ELISA结果表明．其表达水平受无机磷浓度的调控。为了进一步提高表达水平,我们将Pls1中的乙型肝炎表面抗原表达单元插入带完整Pkd1序列的载体Pe1,并将构建成的质粒Pls2转化MW98—8C。在比较了CXJ-7A／Pls1和MW98—8c／Pls2后,我们发现MW98—8c／Pls2的稳定性大大提高．表达量也增加4～8倍。     

人类组织特异性DNA聚合酶POLλ2基因的克隆、表达纯化和鉴定

发现并克隆了一个肝脏特异的人类DNA聚合酶基因, 是POLλ的一个剪接体, 命名为POLλ2. 该剪接本的cDNA长2206 bp, 包含一个1452 bp的开放阅读框, 编码482个氨基酸, 位于人10号染色体长臂24区, 长约7.9 kb, 包含8个外显子和7个内含子. 生物信息学分析表明, POLλ2蛋白和DNA聚合酶X家族成员高度同源, 并含有这个家族特有结构域POLx, 因此是一个DNA聚合酶X家族的新成员. 该剪接本的核苷酸序列和相应蛋白质氨基酸序列已提交至GenBank, 登录号为AY302442. 亚细胞定位实验证实, POLl2蛋白定位于细胞核; 人16种组织表达谱实验表明, POLl2在肝组织和睾丸组织中特异性高表达, 在卵巢组织中低表达, 而在其他组织中没有检测到表达. 癌和癌旁表达实验表明, 与正常肝组织和癌旁组织相比, 在15个肝癌组织的样本中有80%样本的POLλ上调表达, 导致POLλ2 和POLλ的mRNA分子的比例异常, 可能和肝癌的病理过程有关. 通过筛选菌株, E.coli BL21(DE3)CONDON Plus可以高效地表达可溶性POLλ2蛋白; 通过Ni-NTA resin 和Superdex-75纯化了POLλ2重组蛋白. 经过同位素α-32P-dCTP掺入实验, 证实了POLλ2具有DNA聚合酶活性.     

在枯草杆菌中有启动子功能的噬菌体T5 DNA片段的克隆

用启动子探针质粒pTG 402为载体,用鸟枪射击法克隆了噬菌体T5 DNA的片段。克隆中的2％含有具启动子功能的插入片段,其中pTG 402-20含有启动功能最强的插入片段。DNA-DNA分子杂交实验结果表明,pTG 402-20的插入片段能与T5 DNA Hind Ⅲ酶切的G和B片段杂交。这个插入片段的大小约为0.84kb。     

化学合成的人a-心房肽基因在SUe2启动子—信号顺序控制下的表达

本文报道将化学合成的人a-心房肽(a-hANP)基因与酵母分秘型表达载体YFD6△21重组,使a-hANP基因在蔗糖酶基因(suc2)启动子—信号顺序指导下,在酵母菌中台成和分泌有活性的a—hANP。放射免疫分析表明：a-hANP基因只有在葡萄糖去阻遏条件下才能得到表达,而且其表达量与细胞浓度成正比。此外,95％以上表达产物被分泌到培养液中。     

用透析膜从琼脂糖胶中回收DNA片段

分离与回收DNA片段是基因操作的重要环节之一。本文介绍了一个用透析膜从琼脂糖胶中回收 DNA 片段的改进方法。利用本法回收DNA片段洗脱容易、节约时间、回收率在80％ 左右。回收的 DNA片段可用于酶切反应、连接反应和用缺口位移反应制备32p标记DNA探针。