巴斯德毕赤酵母Orm1蛋白在细胞生长和内质网功能维持方面的功能

【目的】鉴定巴斯德毕赤酵母ORM1基因;研究ORM1基因缺失对毕赤酵母生长、内质网压力应答、细胞钙稳态调节和活性氧水平等方面的影响。【方法】利用生物信息学软件对毕赤酵母Orm1蛋白进行序列比对和分析;利用PCR介导的同源重组法构建orm1Δ缺失菌株,将回补质粒p IB1-ORM1转入orm1Δ菌株构建回补菌株;研究ORM1基因缺失对毕赤酵母生长的影响;以Fluo-3 AM染色法测定胞质钙含量;以DCFH-DA染色法分析胞内活性氧水平;以实时荧光定量PCR技术研究ORM1基因缺失对毕赤酵母非折叠蛋白应答、钙稳态和抗氧化系统基因表达的影响;使用试剂盒分析毕赤酵母抗氧化系统过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性及谷胱甘肽(GSH)的含量。【结果】在毕赤酵母基因组数据库中比对出酿酒酵母Orm1和Orm2的同源蛋白,并将该蛋白编码基因命名为ORM1;毕赤酵母ORM1基因缺失导致细胞生长受到明显抑制,对衣霉素引起的内质网压力敏感性增强,非折叠蛋白应答激活,细胞钙稳态紊乱,活性氧积累,抗氧化系统激活。【结论】由于非折叠蛋白应答、钙稳态调节、活性氧积累等均与内质网功能息息相关,因此,巴斯德毕赤酵母ORM1基因编码的Orm1蛋白在细胞生长及内质网正常功能的维持过程中发挥重要作用。     

氮沉降和刈割条件下羊草光响应模型比较及响应特性

草地覆盖全球陆地面积的40%左右,在全球碳循环中发挥着重要作用。近年来,人类活动,如化石燃料燃烧和畜牧业的发展显著增加了氮在全球环境中的沉积。草地管理方式（如刈割）在介导氮沉降对草地植物的影响方面具有重要作用。因此,筛选合适的模型对光响应过程进行拟合并计算相关参数对研究植物光合特性具有重要意义。依托6种氮添加（NH₄NO₃）梯度和两种草原管理方式（刈割和不刈割）交互处理的野外控制实验,利用Li-6400便携式光合作用系统测定上述实验平台的优势种羊草（Leymus chinensis）的光合作用-光响应过程。采用直角双曲线模型、非直角双曲线模型、指数模型和直角双曲线修正模型4种光响应模型对羊草光响应曲线进行拟合,从参数拟合效果和模型拟合优度筛选氮添加和刈割条件下羊草的最佳拟合模型并分析羊草的光合特性。结果表明：指数模型对表观量子效率（α）、光饱和点（LSP）和最大净光合速率（P_nmax）具有较好的参数拟合效果,非直角双曲线模型的模型拟合优度最好。在所有处理中,羊草均未表现出明显的光抑制现象,具有一定的光合潜力和适应环境变化的能力。适度氮添加和刈割处理能提高羊草净光合速率（P_n）、气孔导度（G_s）、P_nmax、α和LSP等,提升了羊草的光能利用率并拓宽了光强利用范围,但过度氮添加并不能进一步提高光合能力。综上,指数模型和非直角双曲线模型较适用于氮添加和刈割条件下羊草的光响应曲线拟合,施氮浓度为20 g N m^-2 a^-1并刈割是最有利于提高羊草光合能力的草原管理措施。探讨了不同氮添加浓度和刈割处理对优势种羊草的交互影响,从光合作用角度分析羊草的适应机制,将对未来全球氮沉降增加情况下的草地管理方案提供科学依据。     

双向电泳比较两种方法获得的水稻叶片蛋白

水稻是研究单子叶植物遗传和分子生物学的模式植物,是研究植物基因组学和蛋白质组学的一个重要的生物材料。双向电泳作为蛋白质组学中蛋白分离的主要方法,其关键步骤在于蛋白质的提取。为了比较不同蛋白提取方法,采用TCA/丙酮沉淀法和Mg/NP-40提取法分别提取水稻叶片总蛋白,用双向凝胶电泳分离两种方法获得的蛋白。结果表明,在双向图谱中,Mg/NP-40提取法分离的蛋白点数较多,RuBisCO大亚基的含量较低,适于分离等电点在5～7范围内、分子量在14～20kD和高于67kD的水稻叶片蛋白质;TCA/丙酮沉淀法分离的蛋白点数较少,适于分离等电点在4～5范围内、分子量在31～67kD内的水稻叶片蛋白质。     

结构指导的玉米赤霉烯酮水解酶的热稳定性改造

玉米赤霉烯酮是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌(Fusarium)毒素,严重危害牲畜以及人类的健康。来源于粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)的玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase,ZHD)能有效降解饲料中的玉米赤霉烯酮,然而饲料加工中的高温环境限制了该酶的应用。基于结构特征的理性设计可为酶的热稳定性改造提供指导。本研究首先基于蛋白质结构比对(multiple structure alignment, MSTA)筛选ZHD的结构灵活区,随后基于序列保守性打分以及构象自由能计算设计突变文库,得到基于136号和220号残基的9个单点突变设计。结果表明,9个突变体的热熔融温度(Tm)提高了0.4–5.6℃,其中S220R和S220W热稳定性表现最好,Tm分别提高了5.6℃和4.0℃,45℃下的热半失活时间分别延长了15.4倍和3.1倍,相对酶活分别为野生型的70.6%和57.3%。分子动力学模拟分析表明突变位点及附近区域的作用力得到了增强,突变体S220R和S220W的220-K130氢键成键概率分别增加了37.1%和19.3%、K130-D223盐桥成键概率分别增加了30.1%和12.5%,为ZHD热稳定性的提高作出了贡献。这项工作表明结合天然酶的结构比对、序列分析及自由能计算的热稳定性改造策略的可行性,并获得了热稳定性增强的ZHD变体,为ZHD在工业上的应用打下基础。     

不同硝酸盐含量菠菜品种的生理差异分析

采用营养液栽培方式,以4个硝酸盐含量有显著差异的菠菜品种为材料,测定其生长指标（株高、主根长、株幅、柄长、干鲜重和叶面积）、光合色素（叶绿素a、b及类胡萝卜素）含量、光合作用参数(实际光化学量子产率、表观光合电子传递率、光化学猝灭系数、非光化学猝灭系数)、硝酸根吸收速率和硝酸还原酶活性等,研究不同硝酸盐含量基因型品种的生理差异。结果显示：（1）不同基因型菠菜叶片的硝酸盐含量始终存在着巨大差异,且硝酸盐含量与生物量之间没有明显的相关关系,在同样的栽培条件下,生物量大的品种并不代表其硝酸盐含量低。（2）高硝酸盐含量基因型菠菜品种的光合色素含量较低,光合作用效率较差,硝酸吸收速率较高,硝酸还原酶活性较低;而低硝酸盐含量基因型菠菜品种的光合色素含量较高,光合作用较强,硝酸吸收速率较低,硝酸还原酶活性较高。（3）低硝酸盐含量基因型品种SL 06 13的综合评价最好,可以作为选育低硝酸含量菠菜品种的材料。研究表明,菠菜硝酸盐含量的基因型差异产生的原因可能是受硝酸盐吸收和转运的共同影响。     

电穿孔法转染293T细胞条件的优化

为筛选电穿孔转染人胚肾293T细胞的最优条件,将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因克隆至启动子p CMV前,获得的重组质粒在不同电压、质粒浓度和电击次数条件下电穿孔转染293T细胞,继而在倒置荧光显微镜下观察转染细胞,根据EGFP表达情况评价转染效率。结果表明400 V电压、45 mg质粒电穿孔转染293T细胞2次时转染效率达到44%,与脂质体转染效率(51%)无统计学差异。     

白藜芦醇后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤海马CA1区Bax、Bcl-2的影响

摘要 目的：探讨白藜芦醇后处理对大鼠脑缺血再灌注损伤Bax、Bcl-2表达的影响。方法：清洁级雄性SD大鼠60只随机分为假手术组（n=12）、I/R组（n=12）、白藜芦醇组（n=36）,白藜芦醇组按不同剂量分为低剂量、中剂量、高剂量组（10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg）,每组12只。假手术组：仅暴露大鼠颈外动脉,不做缺血处理;I/R组：采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型（缺血2 h,再灌注24 h）;白藜芦醇组：造模方法同I/R组,在大鼠缺血2h后,将不同剂量白藜芦醇腹腔注射入大鼠体内,比较各组SD大鼠神经功能缺损评分、采用Western blotting法、免疫组化法对大鼠脑组织缺血侧海马CA1区Bax和Bcl-2表达进行比较。结果：白藜芦醇低、中、高剂量组神经功能缺损评分均低于I/R组,随着白藜芦醇剂量的增加,神经功能缺损评分逐渐降低,其中白藜芦醇高剂量组神经功能缺损评分降低最为明显;白藜芦醇组与I/R组相比,不同剂量白藜芦醇组Bax表达逐渐减少,而Bcl-2表达明显增加,其中以白藜芦醇高剂量组改变最为明显。结论：高剂量白藜芦醇可以降低大鼠神经功能缺损评分,减轻脑缺血再灌注损伤,对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,其机制与Bax、Bcl-2的表达有关。     

显示纤毛虫细胞微管骨架的两种荧光标记方法

应用直接荧光标记和免疫荧光标记显微术显示了几种原生动物纤毛虫(如尾草履虫、大尾柱虫、阔口游仆虫)的细胞微管骨架,并据结果提出了用所述方法制备标本时需注意的几个方面:对游仆虫,可以忽略某些步骤;对大尾柱虫各种药品的浓度以及处理时间以较小为宜。     

斧头湖水生植物多样性及群落演替研究

根据2009年调查结果,结合分析前人研究资料,研究了斧头湖水生植物多样性及其群落的变化。结果表明从1988—2009年近20年间斧头湖水生植物种类和优势种均发生一定程度的变化,一些对干扰较为敏感的种类如睡莲已经消失,原来的优势种如微齿眼子菜、密齿苦草和轮叶黑藻等变为亚优势种或伴生种;同时出现一些人工栽培外来水生植物。斧头湖水生植被由20世纪50年代的自然演替到目前阶段人为控制下的人工演替,群落演变剧烈,其水生植被覆盖面积、群丛数量和结构以及水生植被总生物量均变化明显,经历一个多(高)—少(低)—多(高)过程。研究表明围网养殖、刈割、引种等人为活动、水生植物生活史、繁殖策略以及水位波动等自然因素可能是引起斧头湖水生植被演变剧烈的主要原因。     

P2X受体调节剂的作用机制与最新研究进展

ATP激活的配体门控阳离子通道P2X受体参与多种生理病理功能,是一类重要的新药靶标。目前发现的多种靶向P2X受体的小分子药物多数因结果未达到预期或存在明显的副作用而止步于临床研究。明确的调节机制可为靶向P2X受体的理性药物设计提供新的方向,从而提高药物发现概率和有效性。本文就P2X受体调节剂的作用机制进行综述,并对靶向P2X受体的小分子药物最新研究进展进行总结。