雌激素受体β真核表达载体的构建及其转录活性

目的：构建雌激素受体（ER）β的哺乳动物细胞表达载体,并检测其转录活性。方法：利用PCR扩增带有Flag标签的人类ERβ全长编码序列,将扩增片段克隆到哺乳动物细胞表达载体pIRESpuro2中,得到重组质粒pIRESpuro2-Flag-ERβ;用Western blot鉴定Flag-ERβ重组蛋白在人胚肾293T细胞中的表达;用含雌激素应答元件（ERE）的报告基因系统检测Flag-ERβ的转录活性。结果：构建了pIRESpuro2-Flag-ERβ重组质粒,其介导的融合蛋白在293T细胞中得到表达,并可以激活含ERE的报告基因的表达。结论：ERβ高效真核表达载体的构建,为进一步研究ERβ在乳腺癌等疾病中的功能奠定了基础。     

cAMP和cGMP对棉铃虫神经细胞高电压激活钙通道的调节作用

用全细胞膜片钳法研究了cAMP和cGMP对棉铃虫Helicoverpa armigera 3龄幼虫胸腹神经节细胞高电压激活钙通道的调节作用。细胞外液中加入腺苷酸环化酶（AC）激活剂福斯克林（forskolin） 0.1 mmol/L,对于Ba²⁺介导的钙通道电流激活电压、峰电压、峰电流变化以及通道激活和电流达到峰值的时间无影响。电极内液中加入1 mmol/L的cGMP则明显抑制峰电流,且抑制作用呈时间依赖性和浓度依赖性,而对激活电压、峰电压无影响。结果提示,棉铃虫神经细胞高电压激活钙通道的活动可能不受细胞内cAMP水平提高的影响,但被cGMP抑制。     

益气补肾方药对化疗荷瘤小鼠免疫功能的影响

目的　探讨益气补肾方药 (由金匮肾气方加味人参、黄芪组成 ,以下均称方药 ,TS)对环磷酰胺 (CY)处理的荷H2 2 瘤小鼠非特异免疫功能的影响。方法　用CY处理荷H2 2 瘤小鼠 ,建立免疫力低下动物模型。用乳酸脱氢酶 (LDH)释放法分别检测NK细胞、巨噬细胞 (M)的活性 ,用RT PCR法检测白细胞介素 12 (IL 12 )mRNA在脾脏细胞中的表达。结果　TS CY组小鼠吸光度A值为 1 332± 0 5 10 ,明显高于CY组小鼠 (P <0 0 1)。TS CY组小鼠A值为 1 12 9± 0 2 80 ,明显高于CY组小鼠 (P <0 0 1)。此方药能明显提高CY所致免疫力低下小鼠NK细胞、M的活性 ,增加IL 12在脾细胞中的表达。结论　该方药可以明显提高环磷酰胺所致免疫力低下荷瘤小鼠的非特异免疫功能。     

剖宫产瘢痕妊娠60例的临床治疗体会

目的:探讨不同类型剖宫产瘢痕妊娠(CSP)的治疗方法。方法:选择经临床确诊为CSP的患者60例,根据CSP的类型分为内生型组(Ⅰ组)19例和外生型组(Ⅱ组)41例,每组再根据不同治疗方法各分为两个亚组,Ⅰ组包括:ⅠA组应用甲氨喋呤(MTX,Methotrexate)后超声引导下清宫术(7例);ⅠB组应用MTX及双侧子宫动脉灌注化疗栓塞术(UACE,Uterine aytery embolization chemotherapy)后超声引导下清宫术(12例)。Ⅱ组包括:ⅡA组行超声引导下清宫术+/-MTX(11例);ⅡB组应用MTX+UACE+超声引导下清宫术(30例)。以妊囊大小、术中出血量、人绒毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin,β-HCG)恢复正常时间、首次治愈率、二次治愈率、住院时间、住院费用及月经恢复正常时间、术后妊娠率作为疗效评估参数比较两组中亚组间相关数据的差异。结果:Ⅰ组中,两亚组妊囊大小、术中出血量、住院天数、血HCG及月经恢复时间、首次治愈率比较差异无统计学意义(P0.05);ⅠA组住院花费明显少于ⅠB组(P0.05)。Ⅱ组中,两亚组住院天数、住院费用及妊囊大小比较差异无统计学意义(P0.05);ⅡA组术中出血量及月经恢复时间明显多于ⅡB组,血HCG下降率及首次治愈率明显低于ⅡB组(P0.05)。结论:CSP可根据类型选用合适的治疗方法。内生型适用于MTX+超声引导下清宫术,而外生型适用于MTX+UACE+超声引导下清宫术。     

单增李斯特菌prsA1基因的截短表达、纯化及多克隆抗体的制备

单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的食源性致病菌,能够引发李斯特菌病,对食品安全构成巨大威胁。prsA1具有保守性和特异性,利用SignalP 4.1 Server程序、TMHMM Server V.2.0程序和SEPPA 2.0程序预测了PrsA1的信号肽段、跨膜区域及空间抗原表位,预测结果显示PrsA1的N端含有信号肽段及跨膜区且该蛋白具有良好抗原表位结构,因而可作为检测靶标。在此基础上,采用PCR法获得prsA1的非跨膜区序列即Δ84prsA1,构建重组质粒pET30a-Δ84prsA1并转入到大肠杆菌中诱导表达Δ28PrsA1,Ni-IDA柱亲和纯化重组蛋白Δ28PrsA1,以纯化的Δ28PrsA1为抗原制备多克隆抗体。间接ELISA检测多克隆抗体的效价,高达1∶128 000。Western blotting分析结果显示该多克隆抗体能够识别从单增李斯特菌中提取的PrsA1蛋白。利用生物信息学筛选检测靶标并分析抗原表位结构,最后成功制备了多克隆抗体,为单增李斯特菌检测靶标的筛选和免疫学检测提供了实践基础。     

中国急性弛缓性麻痹(AFP)病例中脊髓灰质炎病毒疫苗株VP1区基因变异的研究

为研究中国急性弛缓性麻痹(AFP)病例中脊髓灰质炎(简称脊灰)病毒分离株的分子特征,为中国继续维持"无脊灰野毒状态"提供理论依据,对2002年所有省级疾病预防控制中心送检的脊灰分离株,用PCR-RFLP法及ELISA法进行型内鉴定.用PCR-RFLP法筛查出与疫苗株相比有异常酶切图谱的毒株共24株,其中Ⅰ型毒株1株,Ⅱ型毒株21株,Ⅲ型毒株2株;用ELISA法筛查出与疫苗株相比有不同的抗原抗体反应的毒株共22株,其中Ⅰ型毒株7株,Ⅱ型毒株4株,Ⅲ型毒株11株,在7株Ⅰ型毒株中有3株为非疫苗类似株(NSL),其余为双反应毒株(DRV).随后对这46株毒株进行了全VP1区的基因序列分析.结果表明:2002年脊灰分离株都是疫苗株或疫苗衍生株,没有发现野毒株,中国继续保持着"无脊灰野毒状态";口服减毒活疫苗(OPV)株与其它野毒株在稳定性性质方面是类似的,即通常是不稳定的,在人体肠道内有很强的选择性;在人体肠道内,病毒复制产生的基因变异导致毒力升高,是引起疫苗相关麻痹病例(VAPP)的重要原因,但宿主本身的因素也有很大的作用;在局部地区有疫苗株的循环或脊灰疫苗衍生株(VDPV)的存在;最终消除疫苗株引起的AFP病例可能还需要脊灰灭活疫苗(IPV)的介入.     

半理性改造提升细菌漆酶Lac15的催化活性

[目的]漆酶可氧化各种底物,在多个工业领域有很好的潜在应用价值.Lac15是一种微生物漆酶,已表现出可观的应用潜能,可望通过蛋白质工程改造提升和拓展其应用.[方法]通过基于结构分析的半理性改造策略,选取推测与电子/质子转移或底物结合直接或间接相关的位点进行定点突变,并测定突变酶对各种底物的活性及酶学性质.[结果]部分突...     

杜氏盐藻DCA1启动子内GT重复序列在盐诱导调控中的作用

为了研究杜氏盐藻双拷贝碳酸酐酶（DCA1）启动子中高度重复的GT序列在盐诱导表达时的调控作用,设计不同的引物,通过PCR法获得6条不同长度的DCA1启动子片段,分别与gus报告基因融合后构建6个表达载体;电击法转化杜氏盐藻细胞。组织化学染色和荧光定量法检测GUS在不同盐浓度下的瞬时表达。结果显示,DCA1启动子内高度重复的GT序列无论与其上游、下游或上下游片段同时结合均能驱动gus基因的表达,并且其表达受氯化钠浓度调控,其中和上下游均结合时活性最强;无GT重复序列的融合片段及GT 重复的下游片段也能驱动gus基因的表达,但其表达不受氯化钠浓度调控;而GT重复的上游片段不能驱动gus基因的表达。结果提示:盐藻DCA1启动子中高度重复的GT序列在盐诱导调控中起重要作用,可能为一种新型的盐诱导元件。     

电子传递链的适配提高孕酮17α羟基化生物催化效率

17α羟化酶是转化孕酮制备各种孕激素药物中间体的关键酶。为提高该酶在生物催化中的特异性羟基化能力,本研究将来源于纤维素黏性细菌(Sorangiumcellulosum)Soce56的羟化酶CYP260A1与大肠杆菌(Escherichia coli) K-12来源的Fpr和牛肾上腺来源的Adx4-108组建成新的电子传递系统,用于孕酮的生物转化。通过对CYP260A1进行选择性突变,获得17α羟化酶活性显著提高的突变体S276I,经体外催化体系的优化设计,使17α-OH孕酮的产率达到58%。此外,利用定点突变技术探究铁氧还蛋白Adx4-108的模拟磷酸化对17α羟化酶活性的影响,结果显示,突变体Adx4-108T69E向S276I传递电子,进一步增强了对孕酮C17位的特异性,17α-OH孕酮的产率最终提高到74%。本研究为细菌来源的17α羟化酶特异性转化生产17α-OH孕酮提供了新的方案,为孕激素类药物在工业上利用生物转化法生产奠定了理论基础。     

miR-659-3p靶向CTNNBIP1调控甲状腺癌细胞凋亡的机制

[目的]探讨miR-659-3p在甲状腺癌细胞中的潜在功能和机制。[方法]纳入甲状腺乳头癌患者60例,比较甲状腺患者癌旁组织和癌组织中miR-659-3p的表达水平。过表达或敲低miR-659-3p后检测甲状腺癌细胞TPC-1的增殖水平和凋亡水平,并进行底物鉴定。[结果] miR-659-3p的表达水平在60个甲状腺癌组织中也显著上调(P<0.05)。miR-659-3p敲低后TPC-1的增殖水平显著下降(P<0.05)、 TPC-1的凋亡水平显著上升(P<0.05)。敲低CTNNBIP1时,TPC-1的凋亡水平下降(P<0.05)、 TPC-1的细胞活力水平上升(P<0.05)。过表达miR-659-3p时,CTNNBIP1的蛋白水平和mRNA水平显著下降(P<0.05);敲低miR-659-3p时,CTNNBIP1的蛋白水平和mRNA水平显著上升(P<0.05)。过表达miR-659-3p后,Wnt/β-catenin通路的关键蛋白β-catenin的核定位增多;敲低miR-659-3p后,β-catenin的核定位减少。[结论] miR-...