冬虫夏草不同发育时期蛋白质组iTRAQ质谱分析

本文选定冬虫夏草寄主昆虫幼虫（S1）、僵虫（S2）、子座初期（子座<1cm,S3）、子座早期（1cm<子座<3cm,S4）、成熟冬虫夏草（子座>7cm,S5）、商品冬虫夏草菌核（S6）、商品冬虫夏草子座（S7）及商品冬虫夏草（中期子座≈5cm,S8）8个样品,用定量蛋白质组学方法iTRAQ分析技术对冬虫夏草不同生长发育阶段的差异蛋白质组进行比较。共计获得9 924个不同肽段,鉴定到1 809个蛋白质,其中差异比值1.5倍以上,P<0.05蛋白个数506个,以商品冬虫夏草样本（S8）为参照,比较差异蛋白数量,寄主幼虫（S1）、僵虫（S2）、子座初期（S3）、子座早期（S4）、成熟冬虫夏草（S5）、商品冬虫夏草菌核（S6）及商品冬虫夏草子座（S7）阶段差异蛋白数分别为104、102、34、35、49、46和136个,说明昆虫幼虫、僵虫及子座与商品冬虫夏草样品差异显著。对鉴定蛋白质数据进行了主成分分析（principal component analysis,PCA）,在第三主成分（component 3）上的显著差异,表明成熟冬虫夏草（S5）的蛋白组成不同于商品虫草,说明成熟虫草品质下降。层次聚类（hierarchy clustering）分析结果表明所有样品分为两支,僵虫（S2）和商品冬虫夏草菌核（S6）与寄主幼虫（S1）聚在了一个分支上,而不同发育阶段样品（S3、S4和S5）与商品虫草子座（S7）聚在一个分支上,说明商品冬虫夏草菌核中还残留有寄主昆虫蛋白。冬虫夏草菌核部位的蛋白到子座部位的蛋白呈现由寄主幼虫蛋白向真菌蛋白发育过渡的聚类关系。子集嵌套关系同步子实体生长发育阶段蛋白组成变化随时间的程序性变化的规律。K-均值（K-means）聚类和Gene Ontology（GO）注释分析,提供了冬虫夏草成熟过程中能量代谢通路的变化趋势以及与真菌侵染昆虫和有性生殖相关蛋白质信息。研究结果为理解寄主昆虫对冬虫夏草功能的潜在贡献、子实体形成和发育的分子机制提供借鉴,并为蛋白质组作为冬虫夏草质量标准提供了科学参考。     

分子模拟在门冬酰胺酶Ⅱ表面呈现多肽技术中的应用

简要地介绍了表面呈现技术和组合酶技术的应用以及发展前景,描述了一种应用分子建模系统辅助进行抗动脉粥样硬化的嵌合酶疫苗的构建过程。门冬酰胺酶活力测定结果证明,嵌合酶的空间结构和活性位点均能够依照设计要求保留。提供了一种生物信息学手段在组合生物合成领域中的应用方法。     

冬虫夏草繁育品和野生品虫草酸含量比较

为了建立冬虫夏草中虫草酸含量的检测方法,比较冬虫夏草繁育品和野生冬虫夏草中的虫草酸含量,文中采用超声水提法研究了料液比和提取时间对虫草酸含量的影响,筛选出料液比为1∶50、提取时间为5 min时可高效提取冬虫夏草样品中的虫草酸。检测方法经方法学考察,专属性、重复性、准确度、稳定性均符合要求;21批冬虫夏草繁育品样本中的虫草酸含量为9.04%~14.14%;21批野生冬虫夏草虫草酸含量为6.16%~13.94%。通过t检验统计分析显示,冬虫夏草繁育品和野生冬虫夏草的虫草酸含量差异不显著,具有良好一致性。     

冬虫夏草MYB家族基因鉴定及其在生长发育中的表达分析

MYB蛋白是一类广泛存在于真核生物中的转录因子,在真菌的生长发育中发挥调控作用。本研究对冬虫夏草菌中的潜在MYB转录因子家族基因进行了全基因组鉴定和生物信息学分析,并研究了MYB家族成员在冬虫夏草生长发育不同阶段和不同部位的表达模式。结果表明,冬虫夏草MYB转录因子家族包含3个1R-MYB和3个2R-MYB;6个MYB转录因子蛋白均包含近50个保守氨基酸序列,形成螺旋-转角-螺旋的结构。通过分析MYB转录因子基因在不同发育阶段（MYB-1-6）和子实体不同部位（MYB-1、3、6）的相对表达量,发现MYB-1在冬虫夏草整个发育阶段表达较为稳定,MYB-3在子实体成熟阶段（MF）表达量最高,远高于其他阶段,且在MF的顶部可育部分MF-3高表达,表明其可能参与冬虫夏草子实体的有性发育;MYB-6在子座发育初期（YF）的中部YF-2表达量最高,为菌丝阶段（HY）的5倍,表明MYB-6可能参与子座柄部的伸长。     

重组人胰高血糖素样肽-1类似物的分离纯化和鉴定

将合成的人胰高血糖素样肽-1类似物基因插入到原核表达质粒pGEX-4T-3中,构建成rhGLP-1类似物与谷胱甘肽巯基转移酶（glutathione-S-transferases,GST）的融合表达载体pGEX-rhGLP-1类似物,转化大肠杆菌BL21（DE3）获得重组菌株。IPTG诱导表达的菌体经高压均质机破碎后,离心收集包涵体,经尿素变性、Glutathione-Sepharose 4B亲和层析、肠激酶酶切、SP-Sepharose FF层析和反相层析RP-C18脱盐后冻干,得到纯度大于96%的rhGLP-1类似物,经质谱测定,分子量与理论值一致。生物学活性分析表明,rhGLP-1类似物具有促进表达有GLP-1受体的HEK293细胞cAMP增加的活性。     

冬虫夏草寄主昆虫选育及生殖退化研究

选育发育速度快、繁殖能力强、中国被毛孢侵染率和冬虫夏草产出率高的寄主昆虫品系是冬虫夏草培植的基础,同时明确冬虫夏草的寄主昆虫蝙蝠蛾退化机制是保证冬虫夏草培植的条件。本文从冬虫夏草产区采集蝙蝠蛾种群种质资源,分别针对蝙蝠蛾发育速度、繁殖能力、中国被毛孢侵染率、冬虫夏草产出率4个方面通过杂交及四代选育,获得新种群（A1）,该种群对冬虫夏草繁育环境的适应力强,发育整齐度高,繁育一代的种群扩繁倍数从8.2倍提高至26.3倍;对中国被毛孢的敏感性较好,侵染率高,冬虫夏草产出率从原始种群的11.2%提高至18.5%。同时,仿照高原生态环境长期饲养冬虫夏草的寄主昆虫蝙蝠蛾,其子代出现雌雄比失调、发育历期分化、生殖力降低等退化现象。经过研究分析得知卵孵化率下降的主要原因是雄性的生殖力下降。组织切片观察蝙蝠蛾雄性生殖系统,在幼虫后期、蛹、成虫期会出现生精囊减少及畸形等异常情况,推测此为雄性生殖力降低、卵孵化率下降的生理原因。研究结果为高效、稳定地饲养蝙蝠蛾保证冬虫夏草培植具有重要意义。     

蝙蝠蛾幼虫感染粉棒束孢后的病症、组织病理变化及侵入途径

蝙蝠蛾幼虫的饲养是冬虫夏草培植的先决条件,粉棒束孢作为蝙蝠蛾幼虫饲养过程中的一种常见和主要致病菌,具有极强的致病性和流行性。结合形态学观察和组织切片技术,本文研究了蝙蝠蛾幼虫感染病原菌粉棒束孢后的症状、主要组织病理变化及粉棒束孢侵染蝙蝠蛾幼虫的途径。结果表明,用浓度为1×10⁵个/mL的粉棒束孢分生孢子悬液处理蝙蝠蛾5龄幼虫,4d后在腹部气门处有黑斑出现,气门变黑,虫体随后瘫痪死亡、体色改变、收缩化僵、菌丝层包裹、形成众多孢梗束等症状。幼虫被粉棒束孢感染后,菌丝体首先利用血淋巴进行增殖,脂肪体、肌肉、消化道、丝腺和马氏管等主要组织器官先后出现不同程度的破坏,虫体体腔被大量菌丝充斥并最终僵化。组织切片观察结果表明,粉棒束孢可以通过气门侵入蝙蝠蛾幼虫体内并造成虫体死亡,菌丝穿透气管进入血淋巴后断裂成许多长短不一的短菌丝段,目前尚未观察到菌丝直接穿透幼虫体壁和从消化道侵入的现象。本研究为蝙蝠蛾幼虫饲养过程中的病害防治提供信息参考。     

基于虫菌双重PCR快速鉴别冬虫夏草

为了快速准确的鉴别冬虫夏草(Chinese cordyceps)及其混淆品,基于冬虫夏草虫体部分含有寄主昆虫和寄生菌基因组DNA,以寄主昆虫细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因及冬虫夏草菌rDNA ITS区设计特异引物(CC-2F/CC-2R,DCF4/R4),通过对双重特异性聚合酶链式反应(PCR)进行优化,结果成功从冬虫夏草虫体部分扩增出220 bp和146 bp 2条特异性条带,而其混淆品无目标条带或部分条带缺失。不同模板稀释倍数考察结果表明该方法灵敏度较高,对冬虫夏草样品检测具有稳定的特异性,且能够快速鉴别冬虫夏草真伪,为冬虫夏草产品质量评价的提升提供了支持。