基因Ⅰ、Ⅳ型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用

设计针对国内流行的戊型肝炎病毒(HEV)基因Ⅰ、Ⅳ型,在这两型序列的保守区域设计了一套RT-PCR引物——E引物,并将E引物与目前较常用的3对通用引物(Meng、ConORF1和ConORF2引物)比较了检测基因Ⅰ、Ⅳ型HEV的灵敏度。对基因Ⅰ型HEV,E引物能检出的稀释度为105,参考引物能检出的稀释度为10^2～10^4;对基因Ⅳ型HEV,E引物能检出的稀释度为10^2,参考引物能检出的稀释度为10^1～10^2。在17份HEV-IgM阳性血清中,E引物检出5份,检出率为29．4％;参考引物只能检出1份或2份,检出率最高为11．8％。E引物在33份HEV-IgM阳性的隐性感染血清中检出6份,阳性率18．2％;在79份HEV-IgM阳性的临床肝炎血清中检出36份,阳性率45．6％。以上结果初步表明,对于在国内流行的基因Ⅰ、Ⅳ型HEV,E引物的检测灵敏度要高于目前常用的通用引物。     

红细胞成熟脱核机制的研究

面对解决血液来源匮乏的问题,开发新的血源已经成为当前医疗中的迫切需要,其中一种重要的手段就是体外产生功能性的红细胞,而脱核是关键的一步．虽然目前的研究表明已经可以在体外条件下产生成熟的脱核红细胞,但是诱导分化的效率相对比较低．不仅如此,我们对红细胞脱核机制研究的并不是很清楚．本文对于目前研究比较成熟的三种脱核理论,包括细胞凋亡学说、不对称分裂学说、膜泡运输理论,以及脱核过程中重要的蛋白质、microRNA进行了阐述,并对体外制备血细胞的前景进行了展望．     

细菌糖基化基本元件及其应用研究进展

近年来,细菌糖基化修饰系统的研究受到了越来越广泛的关注.已有文献报道了诸多细菌糖基化修饰系统,包括最具有代表性的空肠弯曲杆菌的N-糖基化修饰系统以及脑膜炎奈瑟菌的O-糖基修饰系统.本文在已有的研究基础上进行了系统的归纳总结,讨论对细菌蛋白质糖基化系统的理解,同时综述了细菌蛋白质糖基化应用方面的相关进展.     

大肠杆菌表达的戊型肝炎病毒ORF2多肽对恒河猴的免疫保护研究

在大肠杆菌中表达的一段戊型肝炎病毒（HEV）结构蛋白NE2,纯化后以弗氏佐剂,按0d,10d,30d的方案10μg/针的剂量免疫3只恒河猴,在第2周抗体阳转,第6周时1只滴度达1∶100 000,另2只滴度1∶20 000,此时以106 PCR滴度的HEV病毒粪悬液攻击。对照组3只均出现血清转氨酶（ALT）升高,抗体阳转,粪便持续排毒1月以上;疫苗组无一发病,未检出非疫苗来源的抗体,其中1只始终未检出粪便排毒,另2只仅出现短暂排毒。以一份NE2免疫后猴血清（滴度1∶20 000）与103 PCR滴度的病毒混匀后感染2只恒河猴,结果对照组2只均持续排毒3周以上,抗体阳转,1只ALT明显升高;而抗体中和组2只猴始终未检出粪便排毒,抗NE2抗体缓慢下降,ALT正常。这些结果表明NE2具有良好的免疫原性和免疫保护性,有可能成为有效的戊肝疫苗。     

疫苗产业概况及疫苗技术新进展

疫苗被认为是20世纪最伟大的公共卫生成就之一，是最经济、有效、安全和方便的疾病预防方式。通过广泛的疫苗接种，诸如天花等长期以来严重威胁人类健康的传染病已被消灭。麻疹、破伤风、白喉、B型流感嗜血杆菌，以及其他病原体所致传染病也通过有效的疫苗得到了控制。统计数字表明．疫苗每年能够拯救近600万人的生命。     

细胞角蛋白19启动子调控的双报告载体的构建及其在肝干/祖细胞分化研究中的应用

肝干/祖细胞是肝细胞和胆管上皮细胞(biliary epithelial cells,BECs)共同的前体细胞,为了对这一前体细胞的分化情况进行研究,利用报告基因来监测肝干/祖细胞的分化走向．首先,通过PCR方法从肝癌细胞系HepG2的全基因组中克隆了细胞角蛋白19(CK19)启动子片段,构建了CK19启动子调控的海肾荧光素酶和红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)双报告载体(pSicoR-CK19-hrl-mrfp)．其次,将上述慢病毒载体转染肝干/祖细胞后,通过流式细胞分选获得稳定转染的细胞株．再次,将上述细胞株与表达“上皮形态发生素”(Epimorphin,EPM)的PT67细胞共培养后,整合有pSicoR-CK19-hrl-mrfp表达载体的肝干/祖细胞不仅形态发生了变化,而且排列为二维环状结构,另外还检测到由CK19启动子启动表达的海肾荧光素酶和RFP,细胞形态和基因表型都证明肝干/祖细胞经诱导已经分化成为BECs．与此形成对照的是肝干/祖细胞与不表达EPM的PT67细胞共培养后,没有观测到上述的变化．所以,CK19启动子调控的双报告载体不仅可以实时地显示肝原始细胞在不同的诱导环境下的分化走向,而且还可以定量地检测CK19启动子活性的变化情况．总之,这一载体的成功构建将为研究肝干/祖细胞的分化提供了便捷的工具,同时也有助于筛选可诱导肝干/祖细胞定向分化的分子．     

HPV16/18假病毒中和抗体检测方法的验证

目的应用假病毒中和法建立检测血清HPV16/18中和抗体滴度检测方法并进行验证。方法分别采用不同批次假病毒以及不同代次细胞对不同滴度的HPV16/18阳性血清进行多次平行检测,考察这些因素对检验结果的影响;同时通过对抗HPV16/18双价阳性血清、抗HPV16单价阳性血清和抗HPV18单价阳性血清的检测进一步评估中和抗体检测法的准确性、特异性及重复性。结果不同批次假病毒和不同代次细胞对检验结果的影响均在4倍范围内,此外该检测法的准确性、特异性、重复性均在可接受标准范围之内。结论建立的假病毒法可满足中和抗体效价检测的要求,可用于评价疫苗的免疫效果。     

戊型肝炎病毒中和性单克隆抗体的鉴定

阻断实验发现。用戊型肝炎病毒(HEV)衣壳蛋白重组抗原制备的8株抗HEV单克隆抗体(mAb),分别识别3个构象表位和2个线性表位。用抗体捕获反转录PCR方法证实,其中识别2个构象表位的3个mAb可以直接捕获HEV颗粒,表明这2个表位位于HEV颗粒的外表面。识别这两个表位的mAbSCll和8H3均可中和HEV对恒河猴的致病性和感染性。rnAb8C11缩短排毒时间的效应较明显,而mAb8H3延迟机体抗HEV抗体阳转时间的效应较明显。二者的中和效应具有较明显的协同作用。中和单抗8C11、8H3对戊肝不同感染时期的血清均有显著阻断作用,Fab片段的阻断作用与完整抗体类似,表明这两个mAb对应的中和表位是HEV体液免疫应答的优势表位。     

戊型肝炎病毒衣壳蛋白同源二聚体的相互作用结构域

为了探讨戊型肝炎病毒衣壳蛋白同源二聚体形成的关键区域和相互作用结构域,以及二聚体形成与主要天然中和表位的形成之间的关系,通过末端缺失、定点突变技术研究戊型肝炎病毒（HEV）ORF2的aa394-aa606片段NE2的聚合现象,发现其C端的aa597-aa602（AVAVLA）疏水区是该片段同源聚合的核心区域,提高该区域氨基酸的亲水性将妨碍聚合现象的发生;半胱氨酸化学交联实验表明NE2形成同源二聚体时,aa597在空间位置上相接近,处于可生成化学键的距离,提示所处区域为疏水聚合的作用结构域;通过Blast程序估算核心区域的天然突变率,发现其疏水性高度保守;N端缺失实验表明,至少65个氨基酸既不影响同源聚合也不直接参与主要的天然中和表位的形成,但可协助中和表位构象的形成,而这种协助作用可被ORF2的末端肽段所代替。Aa597-aa602（AVAVLA）疏水区为戊肝病毒衣壳组装的第一步骤的核心区域,并与重要的天然中和表位的形成直接相关,从而为戊肝病毒疫苗的研究提供更详细的信息。     

福建沿海地区人T淋巴细胞白血病病毒1型膜基因的克隆和系统树分析

人Ｔ淋巴细胞白血病病毒１型（ＨＴＬＶ－１）是最早发现的一种ＲＮＡ肿瘤病毒。利用ＨＴＬＶ－１基因组长末重复区（ＬＴＲ）或膜基因（ｅｍｖ）序列进行系统树分析,可分为Ｃ、Ｊ、ＷＡ、ＣＡ和Ｍ５个亚型。为了解我国ＨＴＬＶ－１流行区毒株的主要基因型别,从福建莆田地区克隆出３株ＨＴＬＶ－１的ｅｎｖ基因。其序列与已知各亚型代表株进行系统树分析,结果表明均为Ｃ亚型。首次证实了中国大陆ＨＴＬＶ－１Ｃ亚型的存在。该地区