依据乳蛋白基因序列构建反刍动物种系发生树的研究

依据牛的４种乳蛋白（α－乳清蛋白、β－乳球蛋白、β－和К－酪蛋白）基因已知序列设计引物,用ＰＣＲ的方法扩培并生测定了牦牛α－乳清蛋白全序列（２９９９ｂｐ）,水牛的α－乳清蛋白基因全序列（２７８４ｂｐ）,东北马６鹿的α－乳清蛋白基因部分序列（１５８２ｂｐ）,β－酪蛋白基因的５’侧翼序列（９８７ｂｐ）和第４￣第９外显子区序列（１０９０ｂｐ）、β－乳球蛋白５’侧翼序列（２１６７ｂｐ）,３’端侧翼序列（１     

CMV甜瓜分离物外壳蛋白基因的克隆及植物表达载体的构建

从河南省临颖县采集的病毒感染的甜瓜样本经ELISA检测和接种分离获得黄瓜花叶病毒(Cucunber mosaic virus ,CMV) 分离物.把该分离物接种西葫芦, 从发病的叶片中提取总RNA,并以此为模板经RT-PCR扩增获得CMV的外壳蛋白(cp)基因,将其克隆到pUCm-T质粒上.经序列测定和分析,结果表明该cp基因由657个核苷酸组成,编码218个氨基酸.其核苷酸序列与黄瓜花叶病毒亚组I的分离物有较高的同源性,达92.2%～93.9%,与亚组II的同源性仅为76.8%～77.8%,与我国报道的CMV分离物的cp基因序列比较,除香蕉株系XB外核苷酸序列的同源性达91.8%～93.4%.根据这些分析,该CMV分离物属于亚组I.将cp基因通过中间载体pJIT163定向克隆到植物表达载体pBINPLUS中(重组双元载体质粒命名为pBCP),并经冻融法导入农杆菌中,经PCR及酶切鉴定,证实质粒已被导入.利用该植物表达载体对西瓜的遗传转化工作目前正在进行中.     

单卵RT-PCR方法的优化和对牛卵母细胞中发育相关基因的表达研究

到目前为止,虽然许多动物如羊、牛、猪、鼠、兔、马、骡等均已克隆成功,但克隆技术普遍存在着克隆效率低、流产率高、畸胎、巨胎和死亡率高等问题.为了较全面地探索其基因方面的原因,需要对大量的候选基因进行分析.而利用传统的RT-PCR方法从单个卵母细胞或胚胎中获得的RNA量不足以分析大量的基因.为了解决这一问题,利用并优化了一套全新的扩增细胞中整体cDNA的方法,使微量材料进行大量的基因表达分析成为现实.通过该方法研究了与发育相关的重要基因IL6、IFτ、CX43、PSMC3、oct4和DNMT1在牛卵母细胞中的表达.IL6、IFτ和CX43的表达与前人报告的结果相同,而DNMT1和PSMC3在牛卵母细胞中表达情况此前未见报道.     

一种适用于生产转染色体动物的微细胞制备方法

微细胞介导的染色体转移技术(MMCT)是一项将外源染色体转入哺乳动物细胞的技术,具有广阔的应用前景.与体细胞核移植技术结合,MMCT可用于生产具有重要医学药用价值和优良农业生产性状的转染色体动物.制备高质量的微细胞是关系MMCT技术成功的关键步骤之一.通过荧光染色和吉姆萨染色分析,结果表明,A9(neo12)细胞经0.2mg/L秋水仙素酰胺处理48h后,89%的细胞产生微核化,每个细胞平均形成10个微核.微核化的细胞在含有20mg/L细胞松弛B的Percoll密度梯度介质中,经39000g高速离心后,包含微细胞、完整细胞、细胞核和细胞碎片的混合液,依次通过8μm和5μm孔径的滤膜过滤后可获得纯化的微细胞溶液.通过光学显微镜和吉姆萨染色观察,可见微细胞为一群直径约为3～5μm的类细胞核的球形物质.微细胞PCR技术首次用于检测微细胞溶液的质量,检测结果显示,所制备的溶液中均匀分布着带有目的染色体的微细胞,适用于进一步作转染色体动物实验.     

血清PGR、G-17、TK1、RHBDD1联合幽门螺杆菌抗体对萎缩性胃炎与早期胃癌的鉴别价值研究

摘要 目的：研究血清胃蛋白酶原比值（PGR）、胃泌素-17（G-17）、胸苷激酶1（TK1）、菱形结构域蛋白1（RHBDD1）联合幽门螺杆菌抗体（HP-IgG）对萎缩性胃炎与早期胃癌的鉴别价值。方法：选取2018年1月～2021年12月我院收治的202例早期胃癌患者,记作胃癌组。另选取同期萎缩性胃炎和健康体检志愿者各200例,记作萎缩性胃炎组及对照组。检测并比较三组血清胃蛋白酶原（PG）Ⅰ、PGⅡ、PGR、G-17、TK1、RHBDD1水平以及HP-IgG阳性率。比较早期胃癌HP-IgG阳性及阴性患者血清PGⅠ、PGⅡ、PGR、G-17、TK1、RHBDD1水平。采用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清PGR、G-17、TK1、RHBDD1水平联合HP-IgG鉴别早期胃癌与萎缩性胃炎的效能。结果：胃癌组血清PGⅠ、PGR水平均低于萎缩性胃炎组及对照组,且萎缩性胃炎组上述指标水平均低于对照组（均P＜0.05）;胃癌组血清PGⅡ、G-17、TK1、RHBDD1水平以及HP-IgG阳性率均高于萎缩性胃炎组及对照组,且萎缩性胃炎组上述指标水平均高于对照组（均P＜0.05）。早期胃癌HP-IgG阳性患者血清PGⅠ、PGR均低于HP-IgG阴性患者,而血清PGⅡ、G-17、TK1、RHBDD1水平均高于HP-IgG阴性患者（均P＜0.05）。经ROC曲线分析发现,血清PGR、G-17、TK1、RHBDD1水平以及HP-IgG抗体联合鉴别早期胃癌与萎缩性胃炎的效能优于上述五项指标单独鉴别。结论：早期胃癌患者血清PGR存在异常低表达,而血清G-17、TK1、RHBDD1以及HP-IgG抗体存在异常高表达,联合上述五项指标鉴别早期胃癌与萎缩性胃炎的价值较高。     

急性臭氧暴露对大鼠肺部细胞遗传毒性的影响*

目的: 探讨不同浓度臭氧急性暴露对大鼠肺部细胞的遗传毒性的影响。方法: 36只wistar大鼠随机分为对照组(过滤空气暴露)、臭氧暴露组(0.12 ppm、0.5 ppm、1.0 ppm、2.0 ppm、4.0 ppm)共6组,每组6只。以不同浓度的臭氧对大鼠进行动态染毒4 h后,取肺组织并分离单细胞,采用酶联免疫吸附法检测8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG),利用彗星实验、微核试验和DNA-蛋白质交联实验进行DNA和染色体损伤分析。结果: 与对照组相比,肺组织中8-OHdG含量从臭氧暴露浓度为0.12 ppm起即显著增加,在0.5 ppm时达到最高值。随着臭氧暴露浓度升高,彗星拖尾率逐渐上升,且存在明显的剂量-效应关系;DNA-蛋白质交联率有先升高后下降的趋势,且在2.0 ppm时达到最大值;而肺部细胞微核率尽管呈现出上升趋势,但与对照组相比无显著性差异。结论: 急性臭氧暴露在较低浓度(0.12 ppm)时即可导致大鼠肺部细胞的DNA损伤;而在较高浓度(4 ppm)时却未见显著的染色体损伤。     

原生质体诱变选育乳糖酶高产菌株

采用紫外线诱变和^60Co-γ射线协同诱变的方法,对出发菌株Uco-3的原生质体进行诱变处理,通过正突变率与诱变剂量的相互关系,确定最佳诱变剂量。采用4min的紫外线照射和剂量为500Gy的γ射线对黑曲霉Uco-3的原生质体进行诱变,软得一株产高温乳糖酶的高产突变株,突变株产乳糖酶能力显著提高,产酶活力达44．37U／mL,是出发菌株Uco-3的2．73倍。     

哀牢山自然保护区南华片黑颈长尾雉春季觅食地植物群落特征与选择

2008年4月25日—5月16日以系统取样法调查了哀牢山自然保护区南华片黑颈长尾雉(Syramticus humiae)觅食地的植物群落,共记录到植物133种,隶属86属49科。相关性分析结果显示,不同坡位,黑颈长尾雉的出现频率与常绿阔叶林的分布显著相关,这意味着黑颈长尾雉的垂直分布与活动范围受常绿阔叶林分布的影响。黑颈长尾雉偏好选择常绿落叶林。植物重要值排序和物种组成的除趋势对应分析结果表明,觅食地的植物种类组成与常绿阔叶林的相似性较高,而与其他林型分异较大。常绿阔叶林植被的层间组合可提供良好的隐蔽,林内蕨类的茎叶和壳斗科植物的坚果可提供食物。多样性比较结果显示,觅食地植物多样性显著高于华山松林和落叶阔叶林,因此这两种林型均欠缺黑颈长尾雉的植物性食物。故植物多样性和食物丰富度影响觅食地选择。植被因子比较及除趋势对应分析结果表明,除常绿阔叶林,觅食地的乔木盖度较其他林型的高,植被因子与其他林型相似性程度不一。落叶阔叶林乔木稀疏,植被因子与觅食地相似性低且放牧干扰大;华山松林乔木矮小,灌木少;针阔混交林的植被因子与觅食地相似,但人为干扰严重。故隐蔽条件与人为干扰是影响黑颈长尾雉觅食地选择的重要因素。相异性分析结果显示,研究区大部分地区能满足黑颈长尾雉生存基本要求,但最适宜其生存的地区很少。     

基于Red重组系统和Xer重组系统的大肠杆菌多基因删除方法

快速、高效删除大肠杆菌染色体DNA的目的基因是大肠杆菌代谢工程研究的前提和基础。利用Red重组系统结合Xer重组系统删除了野生型大肠杆菌CICIM B0013的ackA-pta基因和pps基因。实验证明了可重复应用dif位点实现大肠杆菌染色体上多基因突变的叠加,同时,在染色体上并未留下抗生素标记,借此能够高效地实现多基因缺失突变株的构建。此外,本方法重组效率高,实验步骤较简便。     

小鼠Lewis肺癌原位模型的建立

目的利用Matrigel与Lewis制备细胞混悬液注射于小鼠左肺内,建立小鼠Lewis肺癌原位模型,评价其肿瘤生长情况、转移情况,以期建立更稳定、更接近于人肺癌生长情况的小鼠肺癌原位模型。方法将处于对数生长期的Lewis肺癌细胞混悬于Matrigel中,接种于C57BL/6近交系小鼠左肺内。分别于第4、7、10、13、16天各处死5只小鼠,观察其局部成瘤率、肿瘤生长情况、中位生存期及肿瘤转移情况,并对各阶段小鼠行肺部,肝脏,肾脏,脾脏病理切片检查。结果术后第7天解剖的5只小鼠中,3只小鼠肺上可见小的瘤结节形成,其余2只肺上未见肉眼成瘤,行病理HE染色检查在显微镜下可见2只小鼠肺脏有小的瘤结节形成。术后第10天以后处死的所有小鼠肺上均有肉眼成瘤,术后第13天,所有小鼠肺原位成瘤并伴有血性胸腔积液、胸腔内转移。术后第25天,有1只小鼠出现上述转移的同时还出现了心包膜转移及肾脏远处转移。5只小鼠生存期分别为17 d、20 d、22 d、22 d、25 d,小鼠中位生存期为21.2 d（17~25 d）。成瘤率100%。结论利用Matrigel法成功建立小鼠Lewis肺癌原位模型,稳定性好,成瘤率高,并具有远处转移的特性,更接近于人肺癌的发生、发展过程。