马传染性贫血弱毒疫苗株核衣壳蛋白基因的表达与鉴定

从感染驴白细胞的马传染性贫血弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码核衣壳蛋白 (pll)的基因 ,在大肠杆菌中得到了表达 ,而表达的蛋白是一种可溶性的融合蛋白 ,其氨基端带有 6个组氨酸的标签 ,因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化。经间接ELISA和免疫印迹试验检测 ,这种表达的融合蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应 ,而与健康马血清无任何反应 ,显示其具有良好的抗原性和特异性 ,可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制及在接种马体内免疫应答的研究。     

用ERIC-PCR结合分子杂交监测焦化废水处理系统(A2/O)中微生物群落结构的变化

建立一种不依赖纯培养 ,可以在废水处理工业现场使用的监测微生物群落结构变化的分子技术。以处理焦化工业废水(A2 /O生物膜工艺 )不同构筑物中的悬浮污泥的微生物群落为研究对象 ,每周采样 1次 ,连续 4周。获得悬浮污泥总 DNA的ERIC- PCR指纹图谱 ,结合分子杂交进一步区分相同条带间的不同序列信息。结果表明 ,在缺氧池 (A2池 )和好氧池 (O池 )之间 ,各个采样点的 ERIC- PCR图谱差异不大 ,悬浮污泥在各构筑物之间交流充分 ;同一采样点的图谱在不同采样时期具有明显差异 ,显示了在此期间微生物群落的连续动态变化过程。通过对生物膜系统中悬浮污泥的微生物群落结构的指纹图谱分析 ,可开发出对该系统微生物群落结构动态变化进行检测的技术     

用ERIC—PCR法研究番茄根际细菌群落结构变化

采用单一碳源回收菌群的方法和ERIC—PCR方法相结合,检测番茄(Lycopersicon escu-lentum Mill．)根际接种转基因微生物E4(Enterobacteria cloacae)后的根际微生物的群落结构和多样性的变化。结果表明：采用单一碳源回收菌群和ERIC—PCR相结合的方法,可以准确、直观和清楚地检测到E4释放到环境中后对根际微生物的群落结构和种群数量的影响。这种单一碳源培养法与ERIC—PCR相结合的方法,将有可能成为一种研究环境微生物群落结构变化的常用方法。     

ERIC-PCR分子杂交技术分析大熊猫肠道菌群结构

目的了解大熊猫肠道微生物区系结构的相似性和稳定性,并找出大熊猫肠道微生物群落结构的变化与健康状况的关系。方法对上海动物园及上海野生动物园所饲养的3只大熊猫2次采集的粪便样品进行微生物群落总DNA的抽提,并以此为模板获得反映肠道微生物群落结构特征的ERIC—PCR和Southern杂交指纹图谱,比较各DNA样品指纹图谱的相似性指数。结果除国庆(大熊猫)的第1次采集的样品(当时处于腹泻状态),其他各DNA样品的ERIC-PCR及Southern杂交指纹图谱的相似性都达到85％～100％;佳斯及川川(大熊猫)2个个体2次采集的样品之间ERIC指纹图谱的相似性分别为93％和87％,而国庆腹泻时的样品与健康时的样品之间则为71％。结论大熊猫不同个体之间肠道微生物群落结构比较相似,而且同一个体在不同时期表现出比较高的稳定性,但当个体的健康出现问题时肠道优势菌菌群结构有一定波动。所采用的DNA提取方法、ERIC—PCR和Southern杂交指纹图谱的高度重复性证明了之一分子生态学技术在大熊猫肠道微生物区系动态监测中的可行性。     

大港孔店油田水驱油藏微生物群落的分子分析

通过多聚酶链式反应温度梯度凝胶电泳（PCRTGGE）和构建16S rRNA基因克隆文库两种方法对比研究了大港油田孔二北断块注水井和采油井的微生物群落结构。16S rDNA V3区PCR扩增产物的TGGE图谱分析表明,这两个油井的微生物群落结构差异很大。注水井样品的TGGE图谱中有6条主要条带,而采油井样品中只有一个条带占绝对优势。同时,建立了两个样品的16S rRNA基因克隆文库,从中分别挑选了108和50个克隆进行限制性酶切片段长度多样性分析（ARDRA）。注水井样品有33个操作分类单元（OUT）,其中6个OUT是优势类型;而采油井样品只有8个OUT,有1个OUT在文库中占绝对优势。克隆文库和TGGE的研究结果一致,均表明注水井样品的微生物多样性比采油井丰富很多。每个OUT的代表克隆序列分析结果表明,注水井样品中的细菌主要属于α、β、γ变形菌纲和放线菌纲,尤其是红细菌亚纲（47%）。采油井样品的细菌主要属于α、β、γ变形菌纲,尤其是假单胞菌属（62%）。油藏微生物多样性的分子分析可为开展微生物采油技术研究奠定基础。     

检测肠道细菌Feacalibacterium prausnitzii的三对PCR引物的特异性比较

【目的】比较3对基于16S rRNA基因、用于检测人肠道中重要细菌Feacalibacterium prausnitzii的引物(FPR-1/FPR-2、FPR-2F/Fprau645R和Fprau223F/Fprau420R)的特异性。【方法】用Clustal X比对每个引物与F.prausnitzii和其他细菌的16S rRNA基因的序列。在Ribosomal Database Project(RDP)数据库中使用Probe Match工具比较每个引物匹配的Faecalibacterium spp.序列数目。利用本课题组建立的中国人粪便菌群的16S rRNA基因全长文库的7255个克隆序列,用Simulated PCR(SPCR)预测每对引物检测到的F.prausnitzii和其他细菌的克隆数;用3对引物分别对代表克隆进行PCR扩增。用3对引物分别对14个健康人的粪便样品进行实时定量PCR。【结果】引物Fprau645R的3端最后一个碱基与非F.prausnitzii序列的错配度高于其它引物,它在RDP中匹配的Faecalibacterium spp.序列数占其匹配的细菌序列数的百分比(97.6%)显著高于其他引物。SPCR预测,3对引物检测到的F.prausnitzii克隆数均为1171左右;在检测到的非Faecalibacterium spp.克隆中,FPR-2F/Fprau645R主要是Subdoligranulum spp.,而FPR-1/FPR-2和Fprau223F/Fprau420R还有Oscillibacter spp.、Ruminococcus spp.和unclassified Ruminococcaceae等。真实PCR与SPCR的结果吻合。实时定量PCR中,FPR-1/FPR-2和Fprau223F/Fprau420R检测到的细菌数量高于FPR-2F/Fprau645R。【结论】3对引物能检测到F.prausnitzii和Subdoligranulum spp.,FPR-2F/Fprau645R的特异性优于FPR-1/FPR-2和Fprau223F/Fprau420R。     

ERIC-PCR指纹图谱技术分析糖尿病小鼠肠道细菌群落变化

目的通过比较1型糖尿病模型组和空白对照组雄性小鼠肠道菌群结构的变化,探索糖尿病造模与肠道菌群的关系。方法收集造模2周后空白对照组(n=5)、STZ造模成功组(n=5)和造模不成功组(n=3)ICR小鼠的新鲜粪便样品,提取粪便样品的总DNA,ERIC-PCR扩增形成DNA指纹图谱,借助多变量统计分析方法研究各组样品肠道菌群结构上的异同。结果ERIC-PCR指纹图谱结合偏最小二乘法(PLS-DA)分析表明造模成功组和造模不成功组小鼠的肠道菌群结构显著区别于空白对照组,而造模不成功组小鼠的肠道菌群结构与造模成功组仍有一定的区别。结论STZ诱导的1型糖尿病会造成小鼠的肠道菌群结构的变化,而部分小鼠造模失败可能与这些小鼠的肠道菌群结构有关。     

分子生态学方法在微生物肥料质量监测中的应用

应用PCR—DGGE技术对某微生物肥料的质量进行了跟踪监测,并结合分离培养和克隆文库分析对其菌种组成进行了检测。结果表明,同一生产批次3个不同包装样品的细菌和真菌DGGE（denaturing gradient gel eleetrophoresis）图谱相似性为80％-100％,3个不同生产批次之间DGGE图谱相似性为80％-88％,表明该微生物肥料的菌种组成的稳定性较好。但分离培养和克隆文库分析结果显示样品的菌种组成与产品标签说明之间存在较大差异。对于产品标注的6种微生物组成,只有Lactobacillus属的微生物可与之对应,其他检测到的Bacillus、Monascus、Brevibacillus、Psudomonas和Penicillium属的微生物并未包括在产品说明中。研究表明用分子生态学方法可以比较客观准确的对微生物肥料质量进行评估和峪测。     

DNA指纹图技术分析微生物肥料菌种组成稳定性

目的 分析2种市售微生物肥料在不同生产批次中微生物菌种组成的稳定性。方法 利用ERIC-PCR基因组DNA指纹图技术和16S rDNA V3扩增一温度梯度凝胶电泳（PCR-TGGE）指纹图技术。结果 这2种微生物肥料在同一个生产批次不同包装之间的2种DNA指纹图谱相似性较高,分别在78%～95%和96%～100%,表明同一个批次内的菌种组成比较一致,但其在不同的生产批次之间菌种组成差异存在显著性,反映在2种DNA指纹图谱上,不同生产批次样品间ERIC-PCR指纹图相似性最低只有10%,PCR-TGGE指纹图相似性最低为46%。结论 通过ERIC-PCR和PCR-TGGE DNA指纹图技术可以对微生物肥料中菌种组成的稳定性进行快速、准确的分析,如何保持菌种组成在批次之间的稳定一致,是复合菌种微生物肥料质量控制中面临的难题。     

专一性PCR和变性梯度胶电泳协助从焦化废水处理装置中分离优势功能菌Thauera属菌株

【目的】在专一性PCR和变性梯度胶电泳(DGGE)的协助下,从废水处理装置的微生物群落中分离较难分离的功能菌Thauera。【方法和结果】本研究首先使用Thauera特异性PCR-DGGE的方法鉴定了焦化废水处理装置反硝化池生物膜中的Thauera在6种培养基、好氧/厌氧条件下的生长情况。挑选Thauera多样性较高的培养基1/10 NB与MMQ在好氧条件下进行分离培养。然后使用Thauera特异性PCR方法确定分离得到的菌落是否呈阳性,并使用DGGE的方法检验其是否为纯菌。使用不同培养基对含有Thauera的混合菌落进行进一步纯化,DGGE检测发现MMP培养基对混合细菌菌落Q20中的Thauera有明显的富集作用。经过Thauera特异性PCR结合DGGE检测对Thauera属细菌进行追踪,将混合菌落在MMP培养基上多次划线,最终分离得到纯菌。通过这种方法,从反硝化池样品中分离获得了3株在样品中最为主要的Thauera菌株。【结论】以特异性分子标记为导向分离培养细菌,不仅提高了分离效率及细菌筛选的灵敏度,还能协助分离常规方法难以分离的细菌。