建立转酮酶酶活测定方法及应用

摘要：目的 转酮酶是非氧化磷酸化戊糖途径中的关键酶。5-磷酸木酮糖是分析测定转酮酶酶活性的底物,然而因该底物难以化学合成,生产成本高,从而导致厂家停止生产,目前市场上无法得到。因此有必要建立起新的转酮酶酶活测定方法。方法 （1）将酿酒酵母的木酮糖激酶基因（XKS1）克隆于pET30a载体。（2）纯化木酮糖激酶。（3）建立酶偶联反应,以木酮糖为底物,将其转化为5-磷酸木酮糖,用于转酮酶酶活的测定。结果 （1）成功地将XKS1基因克隆于pET 30a得到质粒pXZ-X004。（2）质粒pXZ-X004诱导表达产生C端His-tag标签的XK,用Ni柱分离得到纯化的木酮糖激酶(XK)。（3）纯化的XK活性为21.0 U/mg protein,当用12.5%的甘油保存于?80 ℃环境1个月,仍有74%的活性。（4）用纯化的XK建立了转酮酶（TK）酶活测定新方法,当TK酶活低至0.00875 U时仍能够利用新方法检测。结论 本实验通过克隆和表达XKS1基因,成功地建立了TK酶活性测定的新方法,并应用于木糖代谢工程菌株TK酶活的测定,为医学和生态学领域中TK酶活的分析奠定了基础。     

地黄GGPPS1基因克隆及表达分析

以地黄为材料,通过分析地黄转录组数据,设计特异性引物,克隆了地黄牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS）基因的cDNA序列,命名为RgGGPPS1,GenBank登录号为KU258808。同时在生物信息学分析的基础上,进行原核表达、纯化以及组织特异性表达分析。结果显示：（1）RgGGPPS1基因开放阅读框为987 bp,编码328个氨基酸。（2）生物信息学分析结果显示,RgGGPPS1蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD),与芝麻等双子叶植物中的GGPPS蛋白相似性较高。（3）利用构建的原核表达载体pET 32a RgGGPPS1在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达RgGGPPS1重组蛋白,采用Ni²⁺亲和层析得到了纯化的RgGGPPS1重组蛋白。（4）荧光定量PCR结果显示,RgGGPPS1基因在根中表达量最高,叶、茎中表达量较低。研究结果为进一步研究RgGGPPS1基因在地黄环烯醚萜苷生物合成途径中的功能奠定了基础。     

老年人认知训练的神经机制研究

伴随老化,老年人的认知和脑功能会表现出一定的下降趋势.尽管如此,人类的大脑到老年期都会保有一定的可塑性,认知训练的方式是延缓认知和脑功能衰退的有效手段.本文回顾了以往针对老年人不同类型的认知训练研究,探讨了认知训练的理论基础(包括放大观和补偿观),深入分析了老年人认知训练的神经机制,并在此基础上指出以往研究中理论基础冲突的不足和对未来研究老年人训练任务适配性的展望.     

细胞衰老与椎间盘退变的相关性研究进展

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是导致下腰痛的主要原因之一,严重降低患者生活质量,并给家庭带来沉重的经济负担.细胞衰老是驱动IDD的关键因素,而炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍、端粒缩短、DNA损伤、营养剥夺、机械负荷异常和表观遗传学改变介导了椎间盘细胞的衰老进程...     

模糊综合评判法在斜纹夜蛾预测预报上的应用

通过分析多年斜纹夜蛾灯下虫量、田间虫量以及气象资料,采用模糊综合评判的原理和方法,组建了斜纹夜蛾发生量模糊综合评判模型。应用该模型对2006年和2007年斜纹夜蛾田间发生量进行预测,预测结果与田间发生实况基本相符。     

濒危平胸龟两个自然居群的ISSR分析

利用22个ISSR引物研究了28个来自广东从化居群和21个来自福建寿宁居群的野生平胸龟(Platysternon megacephalum)的遗传多样性。结果表明,分布于这两个地区的平胸龟总居群和居群内均具有较高的遗传多样性,而广东从化居群遗传多样性高于福建寿宁居群。居群间的遗传变异度FST=0.3715(P<0.001),遗传分化系数Gst为0.2059。NJ树聚类分析显示,广东从化居群和福建寿宁居群各自聚成两个类群,有较明显的居群分化,具有一定的地理区域性,但基因流Nm为1.9279,这表明平胸龟两自然居群间存在一定基因流。此外,结合BSA技术,从11条引物中筛选出11个可作为鉴别广东从化居群或福建寿宁居群的分子标记。     

人骨保护素(OPG)重组腺病毒的制备及其生物活性研究

采用RT-PCR法得到人OPG的编码区cDNA,克隆至穿梭质粒pShuttle,构建重组有OPG编码区cDNA的腺病毒DNA,经Pac I 酶切线性化,在脂质体介导下转染HEK293细胞,制备重组腺病毒并测定病毒滴度约为5×10⁶～1.5×10⁷ pfu/mL。体外感染小鼠成肌细胞C2C12,Western blot及ELISA检测证实有OPG蛋白的表达,并可在细胞培养上清中持续表达6周。感染OPG重组腺病毒的C2C12细胞生长状态良好、细胞周期无明显变化。将重组腺病毒加入体外培养的小鼠骨髓细胞的培养基中,诱导形成的破骨细胞数量及在象牙片上形成的吸收陷窝的数量显著减少（P<0.01）。      

贝壳状革耳菌染料脱色作用的研究

利用比色法研究了贝壳状革耳菌产漆酶体系在不同情况下对两种不同类型合成染料的降解脱色,结果表明,染料在较低浓度（10mg/L)时,漆酶对其降解迅速而彻底,pH值,培养方式（静态培养,摇瓶培养）对降解作用都有较大的影响;通过在不同时间（0d,6d,18d)向产酶体系中加入染料证实了漆酶活性与染料脱色率呈正相关。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因截短体的克隆与原核表达

禽流感病毒H5N1 NS1蛋白是一种非结构蛋白,在病毒感染过程中发挥着重要的作用.构建基因截短的重组蛋白,可为进一步研究NS1不同结构域与宿主蛋白间的相互作用奠定基础.在成功克隆禽流感病毒H5N1全长NS1基因并测序的基础上,将部分截短基因序列克隆到表达栽体pET28a(+)上,构建基因截短的重组表达质粒pET28a-NS1-RBD和pET28a-NS1-ED,转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性重组质粒经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,然后利用Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对重组蛋白进行纯化,并通过Western Blotting进一步确认NS1及截短体蛋白的表达.结果表明,实验成功构建禽流感病毒H5N1亚型的NS1蛋白截短体,并在大肠埃希菌中高效表达,这为进一步研究NS1蛋白不同结构域与宿主蛋白的相互作用提供了实验材料,为深入研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

洞庭湖滩血吸虫易感地带保水生态灭螺的试验研究

洞庭湖滩血吸虫易感地带保水生态灭螺的试验研究张元培,朱南屏（湖南省水产科学研究所沅江４１３１００）（湖南省华容县血防站４１４２００）ＥｃｏｌｏｇｉｃａｌＥＩｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＳｎａｉｌ（Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ）ｂｙＲｃｔａｉｎｉｎｇＷａｔｅｒｉｎＢｌｏｏｄＦｌｕｋｅ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）Ｓｕｓｃｅｐｔｉ－ｂｌｅＲｅｇｉｏｎｓＡｒｏｕｎｄＤｏｎｇｔｉｎｇＬａｋｅ￥．ＺｈａｎｇＹｕａｎｐｅｉ（ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＦｉｓｈｅｒｉｅｓＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＨｕｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ,Ｙｕａｎｊｉａｎｇ４１３１００）,ＺｈｕＮａｎｂｉｎｇ（ＳｔａｔｉｏｎｏｆＳｎａｉｌＦｅｖｅｒＣｏｎｔｒｏｌｏｆＨｕａｒｏｎｇＣｏｕｎｔｙ,ＨｕｎａｎＰｒｏｖｉｎｃｅ,４１４２００）．ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｃｏｌｏｇｙ,１９９３,１２（３）：２３－２５．Ｉｎｂｌｏｏｄｆｌｕｋｅ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｒｅｇｉｏｎｓｏｆｔｈｅｌａｋｅｂｅａｃｈ,ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｏｆｗａｔｅｒｉｎｕｎｄａｔｅｄｅｌｉｍｉ－ｎａｔｉｎｇｓｎａｉｌ（Ｏｎｃｏｍｅｌａｎｉａ）ａｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｂｕｉｌ