Burkholderia pickettii中D-乙内酰脲酶基因(dha)的克隆、测序及表达

对一株能转化D,L-对羟基苯乙内酰脲为D-对羟基苯甘氨酸的菌株MMR003进行了细菌分类学鉴定,该菌为皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)。实验通过Southern杂交,部分文库构建和筛选,并经一系列亚克隆测序分析,获得一长度为1374bp的完整开放阅读框,编码458个氨基酸的D-乙内酰脲酶基因。用该基因序列构建的高表达质粒pXZPH2转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后,检测到D-乙内酰脲酶活性。该基因编码的氨基酸序列经Blast同源比较分析与放射形土壤杆菌NRRL B11291所产相应酶有85%的同源性。以D,L-对羟基苯乙内酰脲为底物测得的表达酶的活力为0.66u/mL,比相同条件下所测出发菌株MMR003的酶活提高了2倍。     

林肯链霉菌合成林可霉素代谢调节的研究

在摇瓶条件下研究了葡萄糖、铵盐、磷酸盐对林可霉素产生菌林肯链霉菌的生长及林可霉素生物合成的影响。发酵过程中林可霉素的合成主要发生在菌体生长期,逐渐下降。使用6%的葡萄糖未发现通常所说的“葡萄糖效应”。0.2%铵盐有利于细胞生长,但0.8%NH+4对林可霉素的生物合成具有抑制作用。发酵48h后补加0.6% NH^＋_４,对林可霉素的生成没有显著影响。0.05%～0.1%磷酸盐对林可霉素合成具有较强的抑制作用。并就磷酸盐对菌体由初级代谢转向次级代谢的作用作了初步考察。     

GL一7一ACA酰化酶基因片段的酶谱分析及基因定位

本文报道了从假单胞菌130菌株(Pseudomonas sp．130)染色体上克隆得到的6．8kb的GL－7－ACA酰化酶基因片段的限制酶谱,基因定位以及在不同的大肠杆菌基因启动子控制下酰化酶基因的表达水平。结果表明,所克隆的片段上,不存在EcoR Ⅰ、HindⅢ、claⅠI切点,分别具有一个HpaⅠ、两个xhoⅠ、三个BamHⅠI以及四个Pst I切点,同时初步确定了这些酶切位点之间的相对位置。经过一系列次级克隆研究,GL一7一AcA酰化酶基因已被定位在3．Okb的B 2－B3－Hpa Ⅰ片段上。实验比较了以pACYCl84、pDR540、pUCl9等为载体的次级克隆株(分别为pMR9、pMRl0和pMR11)在大肠杆菌中酰化酶基因的表达水平,测定数据表明tac启动子的启动活力比tet启动子强,即pMRl0的产酶量比pMR9高一倍,而当tac启动子前再串接一个lac启动子时(pMRll),产酶水平并不进一步提高。本文还对假单胞菌基因在大肠杆菌中的表达进行了讨论。     

安普霉素的生物合成: 辛二糖C7′-N上甲基的甘氨酸来源

安普霉素是一类结构特殊的氨基糖苷类抗生素, 其分子中含一个稀有的辛二糖结构单元. 迄今为止, 尚无关于安普霉素生物合成途径及其前体化合物的完整报道. 研究发现, 向发酵培养基中添加甘氨酸和丝氨酸均可以出现在菌体生长保持基本不变的情况下促进抗生素产量的现象, 表明甘氨酸和/或丝氨酸可能参与了安普霉素的合成. [2-¹³C]甘氨酸示踪实验的核磁共振(NMR)检测结果表明, 甘氨酸专一地掺入安普霉素辛二糖环C7′-N甲基. 同时发现, 菌体胞内的S腺苷甲硫氨酸(SAM)水平上升与外加甘氨酸的量呈正比, 但是甲硫氨酸的加入会抑制安普霉素的合成. 据报道, 甲硫氨酸对结构中含有甲基取代基的抗生素, 如对rapamycin的 生物合成中转甲基过程有抑制作用. 由此推测, 尽管甲硫氨酸本身对抗生素产量呈抑制作用, 甘氨酸仍然可能通过甲硫氨酸循环提供甲基. 此外, [2-¹³C,¹⁵N]丝氨酸的示踪实验结果表明丝氨酸也可能作为安普霉素的限制性前体物参与了NH₂的合成.     

GL-7ACA酰化酶基因工程菌(Escherichia coli MMR204/pZC1)批式补糖发酵条件优化

戊二酰 7 氨基头孢烷酸 (GL-7-ACA)酰化酶 (3.1.5.11)可有效催化GL-7ACA分子中戊二酰基侧链水解 ,形成7-氨基头孢烷酸 (7-ACA)而成为两步酶法生产7-ACA的重要工业用酶之一。在已构建的GL-7ACA酰化酶基因(acy)重组质粒pZC1基础上 ,进一步对酰化酶基因工程菌EscherichiacoliMMR204pZC1的产酶发酵条件进行了考察。研究表明 ,工程菌的最佳发酵温度为 33℃ ,pH7.5～ 8.5的微碱条件有利于酶的生成。LB培养基补加适量葡萄糖 (1～ 5g/L) ,可提高发酵生物量和产酶水平 ,但葡萄糖的过量补加 (6g/L以上 ) ,则导致发酵液偏酸 (低至pH4.0 )而完全抑制酰化酶生成 ,并证明工程菌生长和产酶对乙酸的抑制效应较为敏感。同时通过5L自控发酵罐的批式补糖试验 ,对恒速流加、pH反馈控制和指数流加等三种补糖模式的发酵产酶进程进行了比较。结果发现 ,三种方式的补糖条件下 ,acy基因在tac启动子控制下 ,呈组成型表达 ,细胞生长与产酶同步 ,无需诱导 ;其中 ,以指数流加方式得到的生物量和产酶水平最高。而从acy基因的表达效率,即比酶活看,pH反馈的补料方法略高于恒速或指数流加模式。     

Burkholderia piCkettii中D-乙内酰脲酶基因(dha)的克隆、测序及表达

对一株能转化D,L－对羟基苯乙内酰脲为D－对羟基苯甘氨酸的菌株MMR003进行了细菌分类学鉴定,该菌为皮氏伯克霍尔德氏菌（Burkholderia pickettii)。实验通过Southern杂交,部分文库构建和筛选,并经一系列亚克隆分析,获得一长度为1374bp的完整开放阅读框,编码458个氨基酸的D－乙内酰脲酶基因。用该基因序列构建的高表达质粒xXZPH2转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后,检测到D－乙内酰脲酶活性。该基因编码的氨基酸序列经Blast同源比较分析与放射形土壤杆菌NRRL B11291所产相应酶有85％的同源性。以D,L－对羟基苯乙内酰脲为底物测得的表达酶的活力为0.66u/mL,比相同条件下所测出发菌株MMR003的酶活提高了2倍。     

提高三角酵母细胞DAO表观活力的透性化研究

三角酵母(Trigonopsis variabilis)的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAO,EC1.4.3.3)是一种胞内酶,完整细胞并不呈现酶促活性。为了获得三角酵母细胞的较高表观活力,需对细胞进行处理以改变壁和膜对反应底物和产物的通透性。研究中比较了冻融、丙酮、丁醇和十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)等理化因子的透性化效率,并对丙酮的透性化条件进行了优化。证明丙酮的透性化作用与溶剂浓度、保温时间和温度有关。30%～35%丙酮浓度,4～28℃保温,可得到最大酶活力。透性化所需时间极短,在5min内即可完成。同时,透性化细胞中的DAO比无细胞抽提液中的酶对热更为稳定。用丙酮透性化细胞作为生物催化剂可有效地转化头孢菌素C(Cephalosporin C, CPC)为戊二酰-7ACA(Glutaryl-7-ACA,GL-7ACA)。     

头状轮生链霉菌中丝裂霉素C抗性基因的克隆及功能研究

头状轮生链霉菌(\%Streptoverticillium caespitosus\%)ATCC27422是抗肿瘤药物丝裂霉素的主要产生菌,实验通过诱变筛选获得不产生丝裂霉素同时对丝裂霉素C敏感的阻断变种S6,并以它为受体宿主,以质粒pIJ699为载体,建立野生型头状轮生链霉菌菌株ATCC27422的基因库。采用鸟枪法克隆技术,从库中筛选获得含有丝裂霉素C抗性基因的62kb外源片段的克隆子。将含此外源片段的质粒pLX5导入变铅青链霉菌(\%Streptomyces lividans\%)获得表达。并且首次成功地运用电穿孔法将pLX5导入野生型菌株中,使其对丝裂霉素C的抗性大幅度提高：最低抑制浓度(MIC)由原来的200μg/mL上升至1000μg/mL以上。摇瓶发酵实验表明：单位菌量的ATCC27422(pLX5)的丝裂霉素产量高于野生菌株ATCC27422,因此丝裂霉素C抗性与产量之间存在一定的相关性。     

林肯链霉菌谷氨酰胺合成酶的酶学性质

在分离纯化的基础上,报道了pH、温度和金属离子对林肯链霉菌(Streptomyceslincolnensis)Z-512谷氨酸胺合成酶(GS)活力的影响及GS底物专一性的研究结果.在动力学性质的研究中,发现林肯链霉菌GS在生物合成反应系统中,对底物NH_4CI的饱和曲线不遵守米氏方程.Hill作图呈两相曲线.在NH_4CI浓度低的情况下,Hill系数大于1,具有正协同效应;当NH_4CI浓度增加到一定程度时,Hill系数小于1,具有负协同效应.这说明NH_4CI不仅作为林肯链霉菌GS的底物,而且作为一种效应物调节GS的活性.林肯链霉菌GS对底物Glu及ATP的饱和曲线遵守米氏方程.在不同的激活离子存在下,GS对Glu、ATP的Km值也不同.