50mL-管摇床培养暨24孔板法筛选麦角菌突变株

麦角菌原生质体用０．３ｍｇ／ｍＬ亚硝基胍（ＮＴＧ）分别处理２０,４０,６０和８０ｍｉｎ。随机挑取ＮＴＧ处理后的原生质体再生单菌落共８０个,分别接种到５０ｍＬ离心管（内装１０ｍＬ液体培养基）中,在２４℃,２２０ｒ／ｍｉｎ摇床上培养１２ｄ。在紫外灯（２５４ｎｍ）下选出４６株荧光相对较中的培养物在２４孔板上作Ｖａｎ Ｕｒｋ蓝色反应分析。挑选９株呈深蓝色反应的菌株作ＨＰＬＣ分析,其结果与２４孔板法有明显的     

7-木糖紫杉烷糖基水解酶Lxyl—pl-1及Lxyl-pl-2的催化特性

糖基水解酶Lxyl-pl－1和Lxyl-p1-2是天然药物活性物质与功能国家重点实验室,卫生部天然药物生物合成重点实验室克隆自真菌香菇的重组蛋白,具有β-木糖苷酶／β-葡萄糖苷酶双重活性,能专一性水解脱除7-木糖-10-去乙酰紫杉醇等的木糖基,生成的C-7位羟基化产物可以作为前体半合成重要的抗肿瘤药物紫杉醇或其类似物。前期工作显示：Lxyl-p1-1和Lxyl-p1-2的序列同源性高达97％,但后者的催化活性是前者的2倍以上;Lxyl—pl-2水解生色底物PNP-Xyl的最适温度为50℃,最适pH为4．0。为系统地观察两酶的催化特性,在对天然药物活性物质与功能国家重点实验室,卫生部天然药物生物合成重点实验室构建的工程酵母进行培养、诱导7d后冷冻干燥菌体。将冷干的菌体破碎得到蛋白粗提物,再经过Ni亲和色谱和HPLC凝胶色谱法制备和纯化得到Lxyl-p1-1和Lxyl-p1-2重组蛋白。以生色底物PNP-Xyl和PNP-Glc及7-木糖紫杉烷底物7．木糖-10-去乙酰紫杉醇（XDT）与重组酶进行反应,重点测定Lxyl-p1-2水解XDT的最适温度和最适pH,并在最适条件下测定重组酶对不同底物的动力学参数。试验结果表明：Lxyl-pl-2水解底物XDT的最适温度为45％,最适pH为4．5;动力学测定结果显示：Lxyl—pl-1和Lxyl-p1-2的β-葡萄糖苷酶活性均显著高于其β-木糖苷酶活性,这与之前的研究结果相一致;Lxyl-p1-1对于底物PNP-Xyl,PNP-Glc和XDT的kcat／Km值分别低于Lxyl-p1-2对于上述3种底物的kcat／Kan值（0．77s-1×mM-1,1．65s-l×mM-1和-1×mM-lVS．1．67S-1xmM-1,2．85S-1×mM-1和1．07S-1×mM-1）。     

采用基因敲除和反义技术抑制酿酒酵母ERG7基因表达

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)固有的甲羟戊酸(MVA)/麦角甾醇代谢途径生成的中间体2,3-氧化鲨烯是三萜类化合物的合成前体,以酿酒酵母为底盘细胞通过合成生物学技术组建这些化合物的代谢途径时,需要下调2,3-氧化鲨烯流向麦角甾醇的代谢流。在酿酒酵母中由羊毛甾醇合酶(ERG7)催化的2,3-氧化鲨烯环化是麦角甾醇和三萜类化合物生物合成分支形成的关键位点。采用基因敲除和反义RNA 2种技术对ERG7基因的表达进行下调。设计含有与ERG7基因ORF两侧序列同源的长引物,以质粒PUG66为模板进行PCR扩增,构建带有loxP-Marker-loxP的ERG7基因敲除组件,采用LiAc/SS Carrier DNA/PEG方法转化双倍体酿酒酵母INVSc1,通过同源重组的方式获得酿酒酵母ERG7基因单倍体缺失突变株,并对其进行了分子生物学确证。大量培养野生型和突变型菌株,菌体冷干后在碱醇溶液中90℃回流1h,正己烷萃取后旋蒸干溶剂,甲醇溶解残留物麦角甾醇。通过TLC和HPLC方法比较麦角甾醇含量,结果表明:与野生型菌株相比,突变型菌株的麦角甾醇含量明显降低。     

加权ceRNA网络筛选乳腺癌生物标志物

竞争性内源RNA (competing endogenous RNA, ceRNA)作为生物标志物和潜在的治疗靶点,在探究肿瘤的发病机制中,表现出了巨大的研究价值和临床应用前景。本文对乳腺癌ceRNA网络进行了系统的分析,首先通过差异分析获得差异miRNA、mRNA和lncRNA,其次利用网络的边聚集系数(edge clustering coefficient,ECC)和皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient, PCC)计算ceRNA网络节点的权重,最后采用基于随机森林的逐步特征选择(stepwise feature selection based on random forest, SFS-RF)方法筛选出一组可作为乳腺癌生物标志物的RNA——LINC00466、CHL1-AS2和LINC00337,并利用GEO数据库验证了该组RNA对乳腺癌样本的识别情况。此外,通过GO和KEGG通路富集分析探索了该组RNA在乳腺癌中的生物学功能。结果显示:这些RNA作为生物标志物,在识别乳腺癌样本方面具有高精度和高效率等特性,在乳腺肿瘤细胞的增殖及遗传物质的合成等过程中具有重要生物学意义。     

人β-分泌酶 (BACE1) 在毕赤酵母中分泌表达及纯化

为了获得活性良好的重组人β-分泌酶 (β-secreatase, BACE1),用于研究其与抑制剂的作用模式,构建了携带β-分泌酶proBACE1和BACE1编码序列的重组表达质粒pPIC9K-MetBACE22和pPIC9K-MetBACE46,通过电击法转入毕赤酵母GS115中,分别得到重组子9k-B22和9k-B46。重组菌株在诱导表达培养基中诱导外源基因表达,结果显示9k-B22的上清活性明显高于9k-B46的上清活性。9k-B22表达上清浓缩后经HisTrap亲和柱纯化得到的蛋白具有良好的BACE1活性, SDS-PAGE/高碘酸-希夫试剂染色发现其为糖蛋白,并且其糖基侧链可以被Endo Hf完全切除,得到50 kDa左右的两条蛋白带。肽质量指纹图谱鉴定发现,这两个蛋白分别与proBACE1和BACE1匹配。活性检测发现糖基化BACE1和去糖基化BACE1的活性均低于HEK-293细胞表达的商品BACE1,这说明糖基化及其类型对BACE1的活性非常重要。然而已知的BACE1抑制剂对三者的抑制率无显著差异,这说明糖基化并不影响与抑制剂的相互作用。经过一系列培养条件优化BACE1纯化产量提高到1 mg/L,这为发现并优化BACE1新型抑制剂的相关研究奠定了物质基础。     

不同施肥黑土微生物量氮变化特征及相关因素

研究长期施用两种不同量有机肥(M2、M4)和化肥(NPK)的黑土微生物量N在作物生长季的变化特征．结果表明,施用有机肥黑土微生物量N显著高于施用化肥(NPK)和不施肥(CK),微生物量N季节波动小．微生物量N为M4 25．52～239．12mg·kg^-1,M2 10．40～94．31mg·kg^-1．NPK6．27～87．04mg·kg^-1,CK9．15～69．81mg·kg^-1,同一处理最大值与最小值相差7～14倍．M2、NPK处理微生物量N最大值出现在抽雄吐丝期,M4处理最大值出现在拔节期,CK处理最大值出现在播种期;不同处理微生物量N的差异并未因季节变化及玉米生育时期影响而明显改变．微生物量N的动态变化与极少数黑土生物、理化特性指标动态变化显著相关;微生物量N与黑土生物、理化特性,植物氮、磷、钾有极显著的正相关关系,与土壤含水量、籽粒粗蛋白含量呈显著正相关关系．     

后基因组时代生物信息学的发展趋势

介绍生物信息学产生背景、发展过程以及研究现状,讨论了后基因组时代分子生物学的主要研究领域功能基因组学、蛋白质组学、比较基因组学、药物基因组学之间的关系。在分析基因组时代和后基因组时代生物信息学所研究内容的差异基础上．说明了基于分层递阶结构的系统结构、特征分析方法以及相应的软件系统开发将成为生物信息学发展的基本趋势之一。     

基于氨基酸特征序列的蛋白质结构分析

针对蛋白质序列中氨基酸的核苷酸组成部分及其相关特征信息,提出另外的σ-等序列的概念,并讨论了其主要特征与次要特征,可作为对蛋白质进行定性和定量比较的一种方法,用来判断这些物种的同源性和相似性程度。然后,对所取的全α螺旋,全β折叠和αβ类序列,利用σ-,τ-,στ序列的概念,给出蛋白质序列的相关氨基酸特征序列。同时对三类共18个蛋白质序列进行数值刻划,给出数值刻划图并进行分析。     

大黄素提高HeLa细胞对三氧化二砷促凋亡敏感性的研究

活性氧(reactive oxygen specis ROS)在三氧化二砷(arsenic trioxide,As_2O_3)诱导肿瘤细胞凋亡中扮演重要角色。本研究用一种天然蒽醌类物质——大黄素(emodin)作为提高HeLa细胞ROS水平的手段,考察其对As_2O_3促凋亡敏感性的影响,并探究可能涉及的信号传导机制。结果显示大黄素10μmol/L提高ROS并增加了HeLa细胞在As_2O_32μmol/L作用下的凋亡率,对正常成纤维细胞却无影响。该联合作用可以促进HeLa细胞线粒体跨膜电位降低;抑制转录因子NF-kB激活。本研究提示:大黄素通过提高ROS介导凋亡信号传导的增强和生存信号传导的抑制,增加HeLa细胞对As_2O_3促凋亡的敏感性。     

长春花悬浮细胞培养体系对脱氢表雄酮的生物转化

利用长春花(Catharanthus roseus(L.)G.Don)悬浮细胞培养体系对脱氢表雄酮进行了生物转化,通过柱层析及制备薄层层析进行分离纯化,并利用核磁共振氢谱、碳谱以及ESI等仪器分析手段进行了化合物的结构鉴定,分离到1 3个转化产物,并对其中的9个进行了结构鉴定,它们分别是:androst-4-ene-3,17-dione(Ⅰ)、6α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione(Ⅱ)、6α,17β-dihydroxyandrost-4-en-3-one(Ⅲ)、6β-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione(Ⅳ)、17β-hydroxyandrost-4-en-3-one(Ⅴ)、15α,17β-dihydroxyandrost-4-en-3-one(Ⅵ),15β,17β-dihydroxyandrost-4-en-3-one(Ⅶ)、14α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione(Ⅷ)和17β-hydroxyandrost-4-ene-3,16-dione(Ⅸ).所鉴定的9个化合物均为首次通过生物转化的方法从长春花悬浮细胞培养体系中分离得到.