水稻叶绿体16S启动子克隆改造、载体构建及转化研究

利用PCR方法从水稻叶绿体基因组DNA中分离16S启动子,并在其下游加入rbcL基因SD序列,以增强该启动子的翻译能力;序列分析表明,除加入的SD序列外,扩增片段与水稻(Oryza sativa)叶绿体基因组DNA序列16S启动子相应区域同源性为100％。将16S启动子与bar基因和gfp基因的融合基因连接,以psbA基因的3′序列为终止子,并以烟草叶绿体trnH—psbA和trnK为同源片段构建了烟草叶绿体表达载体pRl6S。用基因枪转化烟草,转化植株经Southern、Northern检测及后代遗传学分析,发现：16S启动子具有启动活性,融合基因已在烟草叶绿体中稳定整合并遵循母系遗传规律。     

薄层色谱-荧光分光光度法测定淫羊藿药材中淫羊藿苷的含量

目的 :建立了薄层色谱 荧光分光光度法测定淫羊藿药材中淫羊藿苷的含量。方法 :用 70 %乙醇水浴回流提取 ,用醋酸丁酯 甲酸 水 (1.3∶1∶1)在 10℃以下放置后的上层溶液为展开剂 ,展开 ,分离淫羊藿苷 ,在Ex=4 30nm ,Em=4 80nm条件下测定荧光强度。结果 :线性范围为 0 .8～ 4 .8μg ,相关系数r =0 .9973,平均回收率 97.4 8%。结论 :此法简单、灵敏、准确 ,重现性好。     

白细胞膜色谱模型建立与白术中TLR4受体拮抗活性成分筛选研究

筛选发现白术中能够作用于TLR₄受体并具有抑制炎症反应的活性成分. 用硅胶为载体, 制备兔白细胞膜色谱固定相, 建立白细胞膜色谱模型; 以紫杉醇为模型分子, 筛选白术中作用于白细胞膜及膜受体(如TLR₄)的活性成分, 通过置换实验确定活性成分可能的作用靶点; 用整体药理实验验证活性成分的抗炎作用. 结果发现: 白术中白术内酯Ⅰ具有与紫杉醇类似的保留特性, 作用于白细胞膜及TLR₄受体, 其较强的抗炎活性与拮抗TLR₄受体有关. 所以, 本文所建立的白细胞膜色谱模型可以在体外模拟活性成分与白细胞膜及膜受体相互作用, 可用于特定靶标的作用成分和作用特性筛选研究.     

观察"胞间连丝"实验的改进

观察“胞间连丝”是生物学专业及中学生物学演示不可缺少的实验。实验材料一般选用柿核胚乳 ,作徒手切片及染色来观察。本人在多年实验教学过程中 ,曾在前人介绍处理染色基础上进行改进 ,切片用 1%龙胆紫 - 1%次甲基兰(或甲基兰 ) - 1%酸性品红复染法进行观察 ,可当堂完成 ,方法简易 ,效果较好 (《徽州师专学报》自然版 ,1990 .1.)。近两年来 ,又在此基础上对染色方法进一步改进 ,切片改用 0 .2 %龙胆紫溶液染色 10 min左右 ,然后水洗观察 ,可见柿核胚乳细胞壁被染色浅紫色 ,而胞间连丝被染成紫色 (或深紫色 )。此染色方法更简便单一 ,效果…     

生物结构和功能的相似性

在六十年代初期,我们逐渐形成了一种概念,认为在生物现象间具有相似性,而研究其相似性是弄清生物变化规律十分重要的关键。相似性说明事物间有相同的一面,也有不同的一面。相似不是等同。相似性可以在分子水平上反映出来,更多地将在不同层次的生物水平上反映出来。按分子结构的同源性可以将生物活性分子区分为不同大小的家族,“物以类聚”已经在生物科学中得到充分证明。在很多领域,不同层次中已可列举不少生物现象间相似性的课     

中国丁氏双鳍电鳐乙酰胆碱酯酶的制备亲和层析

Acelylcholinesterase was purified from the electric organs of Torpediniforms nacline timelci by affinity chromatography. "Pure" enzyme preparation as identified by PAGE analysis was obtained. The specific activity is 78 mmol ACh/h/mg protein. Sedimentation coefficient is 11.86 S. Molecular weight is 236000. Acidic amino acid and basic amino acid contents are 22% and 12% respectively. Circular dichroism pattern shows two negative valleys at 209 and 220 nm.Optimum substrate concentration is 1-3 mM ACh with Km around 0.18 rnM. Excess substrate causes inhibition of enzyme activity. Optimum pH lies between 7.5-8.0. Bovine serum albumin and phosphatidylcholine benefits the stability of enzyme activity. The pure enzyme can be stored at - 20癈. Repeated freezing and thawing causes sharp inac tivation.     

人转化生长因子β1在大肠杆菌中的表达——Ⅰ.胞内直接表达

采用PCR技术 ,扩增了人转化生长因子β1 (hTGFβ1 )成熟肽基因 ,并对其进行了全序列测定 .采用DH5α/ pBV2 2 0表达系统 ,使TGFβ1在大肠杆菌胞内的表达达到 1 6 % .通过N端氨基酸序列测定和免疫印迹分析 ,证实重组蛋白为hTGFβ1单体蛋白 .采用谷胱甘肽法或CHAPS/DMSO法 ,使重组蛋白的复性率达到 30 % .通过纯化获得了银染一条带的重组蛋白 ,MTT法对Mv1Lu细胞的测活表明 ,重组蛋白具有较强的生物活性     

人肺癌细胞CPP32基因的克隆及表达

蛋白酶尤其是ＩＣＥ家族的蛋白酶是细胞死亡机制的核心成分．ＩＣＥ蛋白酶家族中,ＣＰＰ３２（又称Ｙａｍａ,ａｐｏｐａｉｎ）在不同形式的凋亡途径中起核心作用．为深入研究ＣＰＰ３２的结构与功能,克隆了ＣＰＰ３２基因,并在大肠杆菌中进行了表达．采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人肺癌细胞株中获得了ＣＰＰ３２蛋白酶基因．ＤＮＡ序列分析表明,该基因由已报道的编码ＣＰＰ３２αｐ２０亚单位和ＣＰＰ３２βｐ１０亚单位的核苷酸组成,提示ＩＣＥ家族蛋白酶寡聚化可能受ＤＮＡ水平调控．将获得的ＣＰＰ３２基因分别重组到ｐＢＶ３２１和ｐＥＸ３１Ｂ载体上,并分别转化到大肠杆菌中,均获得了ＣＰＰ３２基因的较高表达,表达产物主要以包涵体形式存在．     

bcl-2高表达细胞株的构建

利用基因转染技术,将人的bcl-2基因cDNA克隆于逆转录病毒载体pLXSN,通过PA317细胞包装成病毒后感染HeLa细胞。经PCR及蛋白质印迹证明转染成功,得到bcl-2稳定高表达株Hbc17。用顺铂诱导凋亡,Hbc17比对照细胞株H1具有明显的抗凋亡能力。为进一步研究顺铂诱导肿瘤细胞凋亡的机理奠定基础。     

E．coli分泌表达载体的构建和人表皮生长因子在E．coli中的分泌性表达

采用ＰＣＲ技术从Ｅ．ｃｏｌｉ基因组片段中克隆出碱性磷酸酯酶（ＰｈｏＡ）的启动子和信号肽序列．在ＰｈｏＡ启动予５＇端设计了ＥｃｏＲⅠ酶切位点,在信号肽编码序列３＇端设计了ＨｉｎｄⅢ酶切位点．将ＰＣＲ产物酶切后ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ片段克隆至ｐＢＲ３２２的ＥｃｏＲⅠ－ＨｉｎｄⅢ位点,组构出含有ＰｈｏＡ启动子和信号肽序列的分泌表达载体ｐＢＭ－Ｐｈｏ－１．之后将人表皮生长因子的成熟肽基因克隆至该载体,使之在Ｅ．ｃｏｌｉ中获得分泌表达,另采用ｐＩＮⅢ载体系统以分泌方式表达了人表皮生长因子。