噬藻体PaV-LD主要衣壳蛋白、穿孔素和内肽酶基因的克隆及表达分析

最近阐明了水华蓝藻噬藻体PaV-LD (Planktothrix agardhii Virus isolated from Lake Donghu)的全基因组序列, 这是一个含有142个ORF的双链DNA噬藻体。在此, 我们对其主要衣壳蛋白基因073R, 内肽酶和穿孔素基因123L-124L(PaV-LD基因组中两个相邻的ORF)进行了基因克隆与表达分析。将073R克隆后构建原核表达质粒pET-32a-073R, 并用IPTG进行诱导表达, 073R融合蛋白经纯化后, 进行免疫小鼠制备抗体; 通过Western blot检测经噬藻体感染宿主细胞后073R的表达时序, 结果显示在宿主细胞裂解之初, 即PaV-LD感染48h以后073R开始表达, 表明073R是一个晚期基因; 同时073R推导的氨基酸序列与34株噬藻(菌)体及2株藻病毒(感染真核藻的病毒)的主要衣壳蛋白的氨基酸序列进行序列比对, 显示073R与无尾的藻病毒衣壳蛋白亲缘关系更近。PCR扩增内肽酶和穿孔素基因123L-124L, 并构建质粒pOP123L-124L, 将其转入模式藻集胞藻PCC6803细胞中, 质粒pOP123L-124L与藻集胞藻PCC6803基因组发生重组, 形成重组藻; 测定了重组藻与野生藻的生长速率, 并绘制生长曲线; 制备超薄切片, 进一步比较和观察重组藻与野生藻的超微结构的变化。结果显示重组藻与野生藻存在生长速率与超微形态的显著差异。       

土壤湿度水平和湿-干循环对硝酸钙盐积累土壤锰释放的影响

在[Ca(NO₃)²]盐处理土壤中,研究了两种湿度水平(200、400g·kg^-1)和湿干循环对土壤Mn释放的影响.结果表明,土壤水分状况影响土壤Mn的有效性,湿度大时,易还原态Mn转化为水溶态、交换态Mn;盐分对易还原态Mn的转化有一定影响,NO₃^-能缓冲土壤Eh的下降,有抑制易还原态Mn转化的作用.连续的湿干循环能使土壤2价Mn(水溶态Mn、交换态Mn)浓度降低,而Ca(NO₃)²盐能增加Mn的不溶性.这在Mn含量低的土壤上,最终将导致Mn的缺乏.     

IBV青岛腺胃分离株(SD/97/02)S1蛋白基因的序列测定和分析

参考Genbank上发表的IBV S1纤突蛋白基因序列,设计了一对引物,对鸡传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株(SD/97/02)RNA进行RT-PCR扩增.将PCR产物克隆入pMD18-T载体中进行序列测定和分析.序列分析表明,该毒株的S1基因的G+C%含量较少,为37.0%,存在HindⅢ,BamHI,BgIII,SacI和SalI位点,无EcoRI位点,与其他毒株的同源性在87.02%-94.21%之间,在第154～429nt处为高度的变异区;将基因序列翻译成氨基酸后,假定的S1蛋白由540个氨基酸组成,等电点8.24,在蛋白质内部存在18个Cys,在S1与S2蛋白之间的剪切位点为HRRRR,这与大多数IBV毒株(RRF/SRR)不一样,有三个区域的氨基酸序列高度保守;169～181aa,230～250aa,485～506aa;与其他毒株进行抗原性比较后发现,在该毒株的320～326aa及390～401aa处的抗原表位消失,而在325～345aa、379～389aa处则出现了很强的抗原表位;第438～444aa处,其他IBV毒株(除ZJ971株外)原来存在的强抗原位点在本毒株中消失;在53～65位的氨基酸抗原性与其他毒株相比明显变弱.     

一个新的RNF6剪切子spg2的克隆和鉴定

环指蛋白是一类含有环指基序的锌指蛋白,它们主要作为毋泛素连接酶,与成泛素结合酶相结合,促进靶蛋白的降解．应用cDNAarray技术,通过对成人和胚胎睾丸进行基因表达谱分析,获得一在成人睾丸中高表达,胚胎睾丸中低表达的环指结构基因RNF6的不同剪切子spg2．它的全长cDNA的可读框为2055个碱基,编码685个氨基酸残基,其羧基端含有一环指结构．NCBIBLAST显示该基因定位于人13号染色体,含有5个外显子．多组织mRNA表达水平研究显示,它在成人睾丸中高表达,胚胎睾丸中低表达．本研究推测spg2可能通过它的环指结构参与人类睾丸的发育．     

一种构建高质量随机肽库的有效方法

为构建完全随机化的基因工程肽库 ,克服现有简并方案中终止密码子和序列组成偏歧的不足 ,提出了一种新的简并DNA文库合成方式。通过这种分组式合成方式构建的肽库可以避免终止密码子的出现和氨基酸组成偏歧的发生 ,还可以控制随机化过程中不同氨基酸的参入比例。以一个 13肽库的合成过程为例对分组式合成法进行了实验 ,测序结果和对 19种氨基酸出现频率的统计表明没有终止密码子和半胱氨酸密码子出现 ,各氨基酸的出现频率接近均值 ,表明这种分组 混合 分组 ,辅以简并合成的方法是行之有效的 ,能满足各类高容量基因工程随机肽库要求。     

一步法双重RT—PCR检测SARS冠状病毒技术研究

参照WHO公布的PCR检测SARS相关冠状病毒的引物序列,我们合成了4对引物,建立了一步法RT-PCR检测SARS相关冠状病毒的方法。利用该方法,对武汉市非典型肺炎疑似病例喉澈液进行了SARS相关冠状病毒检测,其中w20用4对引物检测均在相应的位置出现了DNA条带,W1只有BNIin-s／as引物出现预期产物。同时我们将样品W20的RT-PCR扩增产物进行了序列测定,结果显示该片段序列与其他地区和国家分离的SARS冠状病毒基因高度同源性,这进一步说明RT-PCR扩增的产物是SARS冠状病毒基因片段。在此基础上我们又建立了四种SARS冠状病毒一步法双重RT-PCR检测方法,在一个RT-PCR反应中用两套引物同时对SARS冠状病毒基因两个不同的片段进行检测,检测结果具有更高的特异性。     

论单基因的分离负荷

本文引进两个配子选择系数、三个基因互作系统及互作跃变函数描述分离负荷,统一了近四十年来的理论纷争,得到如下结果：（1）只有当对两个配子的选择系数相等时,种群才能平衡。对平衡种群,以往关于分离负荷的结论是成立的,而且种群的适宜度保持不变;（2）当两配子选择系数不等时,种群不可能平衡,此时选择下分离负荷从F1代开始逐代减小,种群向杂合子纯合方向进化,从而解释了许多过去不能解释的现象。     

鸡传染性支气管炎病毒两个地方分离株S1基因的扩增克隆与序列分析

对IBV肾型毒株JS/95 /0 3和呼吸型毒株SD/97/0 1的S1全基因进行了扩增、克隆和序列测定 ,将两毒株的S1基因序列与 10个参考毒株进行了比较。结果表明 ,JS/95 /0 3和SD/97/0 1分别与M41和H12 0株亲缘关系最近 ,它们可能是疫苗毒株的变异株。JS/95 /0 3和SD/97/0 1间的亲缘关系也较近 ,两者S1蛋白中只有 2 4个氨基酸的差异 ,其中有 15个位于前 130个氨基酸中 ,第 116位氨基酸可能与毒株的致病性有关。对两毒株S1蛋白的二级结构进行了预测和比较 ,结果发现 ,一个或极少数氨基酸的差异即可导致S1蛋白二级结构和抗原性的改变     

基于液流格型特征值和标准化方法分析胸径和土壤水分对荷木液流的影响

基于液流格型特征值-偏度和峰度分析了不同胸径荷木在水分利用方面的差异,并利用标准化的方法消除强影响因子(光合有效辐射,PAR)对液流的影响,研究了弱影响因子(土壤湿度)与液流的关系.结果表明：荷木胸径越大,偏度越小,液流密度峰值越靠后,相应的液流峰值越大,蒸腾量也越大.与旱季相比,荷木大树在湿季偏度较小,液流密度到达峰值时间靠后,峰值大,蒸腾量也大;而小树偏度在旱、湿季的差异不明显,蒸腾量差异也不大.用PAR峰值对荷木个体蒸腾和土壤湿度进行标准化后,荷木个体蒸腾与土壤湿度呈更明显的正相关关系.在土壤湿度较大的季节,荷木大树的蒸腾量随土壤湿度增加而上升的速率基本稳定;而中等木和小树的某些个体则明显下降,说明这些树木的蒸腾和吸收土壤水分的能力可能接近极限.     

希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC 1A01703)二十碳五烯酸生物合成基因簇的钓取及鉴定

希瓦氏菌(Shewanella marinintestina MCCC 1A01703)是从海洋动物肠道分离得到的1株产二十碳五烯酸(Ecicosapentaenoic acid,EPA)的海洋细菌。利用PCR方法、Overlap PCR及Gibson Assemble技术克隆该菌中包含pfaA、pfaB、pfaC和pfaD的EPA生物合成基因簇,全长18.4 kb。序列分析表明所钓取的合成基因簇与来自希瓦氏菌SCRC-2738的EPA合成基因簇有88%的相似度,均编码聚酮合酶。以构建的低拷贝表达载体pACYC-Trc为骨架,通过Gibson Assemble技术构建EPA基因簇表达质粒pLYSCY03。钓取大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)细胞中的entD基因,克隆至表达载体pTrc99a中,构建成为重组质粒pLYSCY01。将两个表达质粒同时导入大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)中,获得产EPA的工程菌株。结果表明,希瓦氏菌中含有EPA聚酮生物合成基因簇,大肠埃希菌(Escherichia coli DH5α)中的entD基因可以替代pfaE基因与钓取的EPA合成基因协同合成EPA。