法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定

应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段.首先用Primer5.0设计1对引物P1、P2,以插入IBDV vp2基因的PMD18-T-VP2载体为模板,扩增出带有终止密码子的1.4kb片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用Sac Ⅰ内切酶线性化后,电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌,经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33/pPICZα-A-VP2.工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示,vp2基因表达产物大小约为55 kDa,比预期的41kDa大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28%,表达量可达23 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清.     

鸭瘟病毒gB蛋白N端主要抗原域的表达及间接ELISA检测

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因.将克隆的基因定向插入pET-32a的EcoR Ⅰ和HindⅢ之间,构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1.将pET-gB1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了DPV gB蛋白主要抗原域的高效表达.免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性.应用His·Bind亲和层析柱纯化重组DPV gB蛋白,以纯化的重组gB1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA.结果表明,抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490＞0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2.应用igB1-ELISA对鸭血清样品进行检测,结果表明igB1-ELISA与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%.     

日本脑炎病毒E基因与流感病毒HA基因的串联表达及应用

根据GenBank公布的日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)SA14-14-2株的核酸序列和人流感病毒的血凝素基因(ha)序列,设计一对特异性引物,用PCR方法扩增编码JEV囊膜蛋白主要抗原域基因,其中含ha基因主要核苷酸序列.将PCR产物定向克隆入原核表达载体pET-32a(+),构建原核表达载体pET-EHA.阳性质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得表达,重组蛋白以包涵体的形式存在.Western-blot分析表明表达产物具有良好的免疫学活性.利用纯化的表达产物与流感病毒血凝素单抗及乳胶建立了诊断日本脑炎病毒抗体水平的乳胶凝集试验.结果表明乳胶凝集方法具有简便快速、敏感性高、特异性强、价格低廉、可现场检测等优点,是一种适合基层兽医单位用于日本脑炎病毒抗体水平检测的新方法.     

随机引物PCR扩增鸡胚致死孤儿病毒DNA的研究

在电镜下观察鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒时,另看到一大小为70~80nm,无囊膜,20面体对称的病毒颗粒.为了解该污染病毒,作者挑选了4条随机引物对此未知病毒分别进行反转录PCR和直接PCR扩增,结果共扩增出3条基因片段,经测序(一个反应)后分析与禽腺病毒1型--鸡胚致死孤儿病毒基因组部分序列同源性分别高达99.5%、99.6%和99.5%.从而得知鸭病毒性肝炎病毒鸡胚尿囊液种毒受到了鸡胚致死孤儿病毒的严重污染.     

毕赤酵母分泌表达JEV prME蛋白及其形成病毒样颗粒的免疫原性鉴定

应用毕赤酵母分泌表达日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prME蛋白,鉴定其表达效果与免疫原性,以期为JEV亚单位疫苗的研制奠定基础。RT-PCR扩增JEV SA14-14-2株prME基因,将其连接到毕赤酵母表达载体pPICZa-A,分别获得pPICZa-prME和携带JEV Cap蛋白C末端19个Aa信号肽的pPICZa-SprME质粒。表达载体用PmeⅠ酶切线性化,通过电转化转入毕赤酵母X33并诱导发酵培养。利用SDS-PAGE和Western blotting鉴定酵母发酵上清中目的蛋白的表达情况。利用GE蛋白层析纯化柱纯化目的蛋白,利用电镜观察纯化前后的目的蛋白,将不同剂量纯化后的prME蛋白与弗氏佐剂混合以及定量纯化后的prME蛋白与不同剂量的核酸佐剂混合分别免疫4周龄小鼠,定期采血,ELISA检测被免小鼠血清的抗体水平,空斑减少试验测定抗体中和效价。SDS-PAGE结果表明毕赤酵母可以分泌表达完整的prME蛋白,目的蛋白在70–100 kDa之间;Western blotting结果显示分泌表达的prME蛋白具有良好的反应原性,进一步证明prME蛋白在酵母X33中以整体的形式分泌表达,没有发生水解切割。纯化目的蛋白,根据洗脱时间和体积表明其分子量大于1×10~6 Da,因此推断prME蛋白可能形成多聚化的颗粒。电镜观察发现直径30–50 nm的病毒样颗粒(Virus like particles,VLPs)。免疫试验结果表明,纯化后的重组蛋白10–15μg/只接种小鼠在3周后抗体达到高峰值,之后逐渐下降,免疫7周后小鼠血清仍可检测到JEV抗体。将prME VLPs以10μg/只的剂量与不同剂量的核酸佐剂配伍后接种小鼠,ELISA检测结果表明核酸佐剂可明显增强JEV prME VLPs免疫应答,免疫4周后小鼠血清的中和抗体效价为1∶80–1∶160。上述结果表明毕赤酵母表达JEV prME虽不能发生水解切割,但仍可形成VLP并诱导免疫小鼠产生较高水平中和抗体。     

猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用

将构建好的重组质粒PET-VP2Ⅰ转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PET-VP2 Ⅰ蛋白主要抗原域VP2 Ⅰ融合蛋白的高效表达.通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性.表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法.结果表明抗原的最佳包被浓度为3.5μg/mL,血清的最佳稀释度为140,待检血清阳性标准初步定为OD490＞0.51,且待检血清的OD490值与阴性血清的OD490值的比值大于2.1.     

几种PCR方法在克隆鸭肠炎病毒未知基因中的应用

以DEV基因组DNA为模板, 用简并PCR、改良Targeted gene walking PCR、改良的热不对称交错PCR和Long-PCR, 获得了5350 bp、11083 bp和2905 bp三段DEV未知基因片段, DNA序列分析发现包含9个开放阅读框, 将这些序列提交GenBank分别获得的登录号为: EF554396~EF554403。结果表明, 多种PCR方法联合使用可以高效的实现对鸭肠炎病毒未知基因的克隆。     

禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因(HA)(GenBank:DQ023145)序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白。PCR产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA。在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法(SOE)用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a( )中,诱导表达获得正确的表达产物。Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应。利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型。本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础。     

重组酵母鸡γ干扰素的抗病毒活性测定及临床初步应用

为了获得具有天然抗病毒活性的重组酵母鸡γ干扰素,以Con A(刀豆素A)诱导培养4~10h的鸡全血中提取的淋巴细胞总RNA为模板,通过RT-PCR的方法扩增出鸡γ干扰素成熟蛋白基因。通过EcoRⅠ和XbaⅠ两个酶切位点把鸡γ干扰素成熟蛋白基因插入到酵母表达载体pPICZa-A上,得到了重组酵母鸡γ干扰素表达载体pPICZa-A-CHIFN-γ,经BstxⅠ线性化后的重组载体被转入酵母菌株X33中,通过PCR的方法来筛选重组酵母菌,在甲醇诱导表达后,SDS-PAGE结果显示有两株重组菌在诱导72h后其表达上清中有大小为16kDa的目的条带。干扰素生物活性测定经典实验(微量病变抑制实验)和临床初步应用结果皆说明重组酵母鸡γ干扰素具有较强的抗病毒的生物活性和较好的临床使用前景。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与免疫试验

本研究构建了编码ILTV主要抗原gB基因的重组DNA疫苗pcDNA-gB,质粒转染293-T细胞的间接免疫表明其表达的蛋白具有免疫反应性.为测定该DNA疫苗的免疫效果,将其与本室保存的重组鸡痘病毒rFPV-gB-gD-IgY分别以单独和混合的方式给4周龄非免疫鸡进行免疫,然后测定ILTV特异性抗体和T淋巴细胞增殖反应.结果表明这2种基因工程疫苗均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答.其中以pcDNA-gB/rFPV-gB-gD-IgY联合免疫组的效果最好,其诱导的抗体水平已接近于常规弱毒疫苗,而细胞免疫水平则比后者高得多.上述研究结果为ILTV 新型疫苗的研究奠定了基础.