插入单个loxP位点的伪狂犬病病毒上海株TK基因缺失株的构建

根据GenBank已发表的pEGFP－C1序列,设计并合成两对引物,PCR扩增出两端各含一loxP位点的GFP表达盒GFP-loxP。克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-GFP-loxP。基于同源重组原理, pSKLR-GFP-loxP与 PRV SH株基因组DNA共转染293T细胞,在BrdU 的筛选压力下,利用蚀斑法在TK-143细胞上筛选出表达GFP的TK基因缺失的重组毒株rPRV1。将表达Cre酶的质粒载体pPOG231与rPRV1基因组DNA共转染293T细胞,在Cre酶的作用下去除GFP表达盒以及一个loxP位点,筛选得到含单个loxP位点的重组病毒株rPRV2。PCR 扩增证实所获得的重组病毒TK缺失270bp,只有一个34bp的loxP位点,并且能在RK-13细胞上稳定传代。LD50试验表明rPrV2的毒力下降。     

猪圆环病毒II型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达

为了建立一种简便的检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本实验将PCV2的ORF2基因片段整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X-33染色体上,构建了X-33(pPICZa-ORF2)重组工程菌.经甲醇诱导后,成功的表达出ORF2基因片段.经过Bradford 蛋白质总含量测定和凝胶薄层扫描结果表明,表达产物占重组工程菌培养上清总蛋白的58%,表达量可达47mg/ L.间接ELISA结果初步表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分PCV2型病毒标准阳性与阴性血清.     

重组magainin抗菌肽表达条件的优化及其对抑菌活性的影响

对magainin抗菌肽重组酵母菌的摇瓶发酵条件进行了优化。结果表明 :当重组酵母菌在BMGY培养基中增殖至OD₆₀₀ 为 5～ 6时转接BMMY培养基 ;BMMY培养基pH值为 6.0 ,表达后期pH值控制在 3.0 ;2 6℃培养 48h ;补加 0.5 %甲醇的同时补加 3%营养液 ;可提高magainin抗菌肽的表达量。优化后摇瓶发酵的表达量可提高到 195 μg/ml。     

PCR快速检测伪狂犬病病毒野毒感染

根据已发表的伪狂犬病病毒(PrV)gE、gI基因的序列,设计并合成了一对引物,以PrV容A株细胞培养毒为模板,筛选最佳反应条件和试剂工作浓度,建立了区分PrV野毒株和疫苗弱毒的鉴别PCR方法.该方法能从PrV容A株(RA)、上海株(SH)、鲁A株(LA)中扩增出一条848bp的片段,但Bartha-K61株没有扩增出该片段.测序结果表明PCR扩增产物和方法的特异性.对正常细胞与其它6种引起猪病毒性疫病相关病毒进行检测,结果均为阴性,没有出现交叉反应.对PrV容A株细胞毒提取物DNA进行检测,其最低检出量为5pg.PCR对感染野毒的发病猪不同组织器官检测发现,淋巴结检出率最高,依次为脾、脑(海马角)、肺、肾、肝等.对2003～2004年期间江苏、浙江、安徽、福建、上海等省市的37个大中型猪场送检的172份病料进行PCR检测病料阳性率为20.34%(35/172),猪场阳性率为40.54%(15/37).实验结果表明所建立的PCR技术可用于伪狂犬病野毒感染的快速鉴定和流行病学调查.     

伪狂犬病病毒ul24基因表达蛋白的胞内定位研究

根据GenBank已发表的PrV ul24基因序列(NC006151),设计并合成一对引物,PCR扩增出ul24基因编码区,克隆于pEGFP-N1载体,得到重组质粒pUL24-GFP.酶切鉴定,测序及Western Blot验证重组质粒.ul24基因序列测定结果已提交GenBank,登录号DQ226544.Western blot分析结果表明UL24-GFP融合蛋白为45KD.将pUL24-GFP转染真核细胞,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞内定位,结果表明UL24-GFP融合蛋白定位于细胞核.     

人源抗菌肽LL-37在毕赤酵母中的高效表达及其活性检测

根据GenBank CAA86115中的LL-37氨基酸序列, 选择毕赤酵母偏好密码子, 采用SOE方法合成了人源抗菌肽LL-37基因。所合成的LL-37基因全长为141 bp, 并在其N端引入kex2裂解位点, 以保证表达抗菌肽具有天然N端。基因克隆入pPICZa-A质粒, 构建分泌型重组酵母表达载体pPICZa-A-LL-37。pPICZa-A-LL-37经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X-33。PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导分泌LL-37于发酵上清液, 其表达量为206 mg/L。表达产物LL-37耐热性强, 在100℃条件下40 min内抗菌活性不变, 煮沸3 h以上仍具有活性。琼脂糖孔穴扩散法检测显示LL-37对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有很好的抑制活性, 其对金黄色葡萄球菌 CowanⅠ(Staphylococcus aureus)、致病性大肠杆菌K99(Enteropathogenic E.coli)和鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)的最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)分别为1.56 mg/mL、3.12 mg/mL和1.56 mg/mL。     

H9N2亚型AIVHA基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank公开发表的禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus,AIV)H9N2亚型血凝素基因(HA)序列设计引物,用PCR方法从重组质粒pUCHA中扩增H9N2亚型禽流感病毒去除信号肽的血凝素基因,将该片段定向插入到原核表达载体pET32a(+)中,构建原核表达载体pETHA。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导,HA基因获得表达,经定位分析,目的蛋白以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变IPTG的浓度和诱导时间,确定了表达HA基因的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.7mmol/L,诱导时间为3h。Westernblot分析表明,重组蛋白能与H9N2亚型AIV阳性血清发生特异性反应。以纯化后表达产物作为诊断抗原包被酶标板建立了检测H9亚型AIV抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原的最佳包被浓度为25μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:OD待检血清>0.5且OD标准阳性血清>1.0;OD标准阴性血清<0.1。     

禽流感病毒血凝素基因突变体的构建及其在293T细胞中的表达

采用PCR定点突变技术,通过重叠延伸法3次PCR扩增,扩增片段上含有所需要的突变位点,最后将扩增片段克隆入pcDNA3载体中,DNA测序表明在预期位点已经发生突变,HA基因裂解位点的氨基酸组成为RKKR↓GLF突变为RSSR↓GLF,通过磷酸钙共沉淀方法将HA基因突变体的重组质粒瞬时转染293T细胞,采用间接免疫荧光鉴定其表达情况。IFA证实突变后的HA在细胞膜上获得了有效表达。HA基因突变体的成功构建,为进一步研究该突变位点导致AIV进入细胞的发病机制和HA蛋白的结构和功能的关系奠定了基础。     

共表达PRRSV修饰的GP5与M蛋白的重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建及其生物学特性

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)修饰的ORF5(MORF5)与ORF6基因分别克隆入笔者构建的改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified vaccinia virus ankara, MVA) 转移载体pLR-gpt的两个多克隆位点中, 构建重组转移载体pLR-MORF5/ORF6。经脂质体介导, 将构建好的pLR-MORF5/ORF6 转染已感染亲本MVA 2h的BHK-21细胞单层, 用药物选择性培养基(MXHAT)在24孔板上进行连续筛选纯化, 得到带有筛选标记的重组病毒rMVAgpt-MGP5/M。将rMVAgpt-MGP5/M 感染表达Cre重组酶的BHK-21细胞(BHK-Cre), 获得删除筛选标记的重组病毒rMVA-MGP5/M。PCR证明MORF5与ORF6成功插入MVA基因组中; Western blotting与间接免疫荧光证明重组病毒能表达MGP5与M蛋白; 重组病毒的生长特性表明与亲本MVA出现病变的时间及病毒滴度基本一致。结果表明, 本研究成功构建了共表达PRRSV MGP5与M蛋白的重组MVA, 并且表达产物具有免疫原性; 外源基因的插入不影响MVA复制, 具较好的稳定性, 从而为PRRSV新型基因工程疫苗的研制奠定了良好的基础。     

奶牛γ干扰素基因的高效表达及活性测定

经刀豆素(conA)刺激诱导奶牛外周血淋巴细胞,应用RT-PCR方法从其总RNA中对奶牛γ干扰素基因cDNA进行扩增,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,测序结果表明,与已知序列同源性为100%。然后将特异性片段连在pRLC载体上进行表达,经SDS-PAGE分析,原核表达产物为16kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的42%,表达产物以包涵体形式存在。经7mol/L盐酸胍的变性液溶解及0.5mol/L盐酸胍复性液处理,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化,细胞病变抑制法结果表明,重组牛IFN-γ具有较高的干扰素活性,约为6.0×105U/mg。