禽流感病毒H5N1亚型HA基因表达及其产物的应用

根据GenBank公布的禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因 (HA) (GenBank DQ023145) 序列设计一对引物P1、P2,以重组质粒pUC-HA为模板扩增去除信号肽的HA成熟蛋白. PCR 产物克隆入pMD18-T载体,经测序发现在967位A突变为T,形成一个终止密码子TAA. 在突变位点附近设计两条有21个碱基配对的突变引物P3、P4,采用重叠延伸剪切法 (SOE) 用A定点替换T碱基,然后将正确的基因片段定向插入到表达载体pET-32a (+) 中,诱导表达获得正确的表达产物.Western-blot分析表明,表达的重组蛋白能与经BL21(DE3)大肠杆菌菌体裂解液处理的H5亚型禽流感病毒阳性抗血清发生特异性反应.利用纯化的重组HA蛋白初步建立了检测H5亚型禽流感病毒抗体的间接ELISA方法,该方法可以代替传统的血凝与血凝抑制方法用于区分禽流感病毒的血清亚型.本研究为禽流感病毒亚单位疫苗及新型诊断试剂盒的研究奠定了基础.     

鸭瘟病毒gB蛋白N端主要抗原域的表达及间接ELISA检测

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因.将克隆的基因定向插入pET-32a的EcoR Ⅰ和HindⅢ之间,构建了gB蛋白主要抗原域原核表达载体pET-gB1.将pET-gB1质粒转化BL(21)宿主菌后,对培养和表达条件进行了优化,实现了DPV gB蛋白主要抗原域的高效表达.免疫印迹试验表明获得的表达产物具有良好的反应原性.应用His·Bind亲和层析柱纯化重组DPV gB蛋白,以纯化的重组gB1蛋白作为检测抗原,初步建立了检测鸭瘟病毒抗体的igB1-ELISA.结果表明,抗原的最佳包被浓度为6.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶80,阳性标准初步定为:待检血清OD490＞0.4,且待检血清OD490/阴性血清OD490＞2.应用igB1-ELISA对鸭血清样品进行检测,结果表明igB1-ELISA与全病毒包被的iDPV-ELISA符合率达到95.6%.     

PRRSV NJ-a株ORF5基因A表位的修饰与糖基化位点的突变对其DNA疫苗免疫效力的影响

为了提高PRRSV ORF5基因的免疫效力,对ORF5基因进行了改造,将CpG序列和通用型辅助性T淋巴细胞表位插入A表位与B表位之间,并对N33与N51位糖基化位点进行了点突变,获得改造的ORF5基因。在此基础上构建了由两个CMV启动子调控的共表达改造的ORF5(MORF5)与ORF6基因的真核表达质粒pcDNA-M5A-6A。经Western-blot与IFA验证真核质粒的体外表达后,免疫6周龄Balb/c小鼠,利用微量中和试验检测免疫后的中和抗体,利用MTT法检测免疫后淋巴细胞的增生情况,并与未改造ORF5基因真核表达质粒pcDNA-5A-6A、弱毒疫苗以及灭活疫苗的免疫效果进行比较。结果表明,pcDNA-M5A-6A不但能够刺激免疫小鼠在较短的时间内产生更高水平的中和抗体,而且可以诱导产生更强烈的T淋巴细胞增殖反应。所构建的共表达PRRSV改造的ORF5基因与ORF6基因的DNA疫苗pcDNA-M5A-6A,能够较好的诱发小鼠产生较高的特异性针对PRRSV的中和抗体和细胞免疫应答,为研究能够更好地防制PRRSV的新型疫苗提供了新的思路。     

猪α1-干扰素的基因改造与高效原核表达

poIFNα1基因中含有大量的大肠杆菌稀有密码子,为了获得高表达,使用了大肠杆菌的偏爱密码子,人工合成了poIFN|α1成熟蛋白编码基因。在保留编码蛋白序列的同时,使其5′端A+T的含量增加到最大限度,并将其终止密码子改为TAA。将合成的poIFNα1成熟蛋白编码基因插入原核单纯表达载体pRLC中,转化大肠杆菌DH5α。实现了poIFNα1在大肠杆菌中的高效表达,表达产物以包涵体形式存在。纯化的包涵体经含DTT的6 mol/L盐酸胍的变性液溶解及含GSHGSSG的复性液复性处理,复性后的表达产物浓缩后经凝胶层析纯化,细胞病变抑制法测定表明,重组poIFNα1具有较高的抗病毒活性,约为6.4x10⁶u/mg。      

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达

为了建立一种简便的检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本实验将PCV2的ORF2基因片段整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X-33染色体上,构建了X-33(pPICZa-ORF2)重组工程菌.经甲醇诱导后,成功的表达出ORF2基因片段.经过Bradford 蛋白质总含量测定和凝胶薄层扫描结果表明,表达产物占重组工程菌培养上清总蛋白的58%,表达量可达47mg/ L.间接ELISA结果初步表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分PCV2型病毒标准阳性与阴性血清.     

奶牛γ干扰素基因的高效表达及活性测定

经刀豆素(conA)刺激诱导奶牛外周血淋巴细胞,应用RT-PCR方法从其总RNA中对奶牛γ干扰素基因cDNA进行扩增,然后将特异性片段连接到pMD18-T载体,测序结果表明,与已知序列同源性为100%.然后将特异性片段连在pRLC载体上进行表达,经SDS-PAGE分析,原核表达产物为16kDa的重组蛋白,占菌体总蛋白的42%,表达产物以包涵体形式存在.经7mol/L盐酸胍的变性液溶解及0.5mol/L盐酸胍复性液处理,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化,细胞病变抑制法结果表明,重组牛IFN-γ具有较高的干扰素活性,约为6.0×105U/mg.     

猪β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其对伪狂犬病毒的抑制作用

了研制高活性的重组猪β干扰素,对PoIFNβ成熟蛋白第3、7和164位的3个氨基酸密码子进行毕赤酵母偏嗜性改造并构建了酵母表达载体pPICZαAPIB。pPICZαAPIB经SacⅠ酶切线性化后电转化导入毕赤酵母菌株X33。多株PCR鉴定为阳性的酵母转化子经甲醇诱导发酵分泌表达了PoIFNβ, 其中B1株酵母的PoIFNβ产量最高,约为2.5×10.5U/mL,其表达量约为60μg/mL,比活为4.17×10.6U/mg。将发酵上清液用PEG20000浓缩后进行SDSPAGE和Western blot检测,结果表明表达产物是分子量约为28kDa和25kDa蛋白的混合物,两者均可与PoIFNβ阳性抗血清发生特异反应。表达产物比PoIFNβ理论推导分子量（约20.8kDa）大,推测可能是表达产物发生了不同程度的糖基化。重组PoIFNβ对伪狂犬病毒在细胞中增殖可呈现抑制作用,并且rPoIFNβ对伪狂犬病毒在MDBK细胞上早期增殖的抑制效果最为明显。     

PCV2 Rep基因启动子区vISRE突变株的生物学特性

摘要：【目的】为了初步揭示PCV2 Rep基因启动子区类干扰素刺激反应元件（vISRE）的生物学功能。【方法】应用感染性克隆技术构建了2株vISRE点突变的重组PCV2,对突变病毒在PK15细胞上的增殖特性、遗传稳定性及对干扰素刺激的反应特性进行了分析。【结果】Rep基因启动子区ISRE点突变后PCV2仍可在PK15细胞中正常复制,但病毒滴度比亲本毒株下降。PCV2 1740G-C在PK15细胞上3至10代之间遗传稳定,PCV2 1741A-T在PK细胞上第3代病毒保持突变基因的特征,但传至第7代时1743和1744位的AC突变为TT,并一直保持到第10代。100U/mL的PoIFN-α处理感染病毒的PK15细胞后,亲本毒株和2个突变毒株的阳性感染细胞数量均有增加,但亲本毒株病毒粒子数的增加显著高于2个突变毒株。【结论】Rep基因启动子区vISRE的突变影响PCV2在PK15上的增殖和对干扰素刺激的反应,推测其可能在干扰素促进病毒增殖中发挥调控作用。     

插入单个loxP位点的伪狂犬病病毒上海株TK基因缺失株的构建

根据GenBank已发表的pEGFP－C1序列,设计并合成两对引物,PCR扩增出两端各含一loxP位点的GFP表达盒GFP-loxP。克隆于转移载体pSKLR获得pSKLR-GFP-loxP。基于同源重组原理, pSKLR-GFP-loxP与 PRV SH株基因组DNA共转染293T细胞,在BrdU 的筛选压力下,利用蚀斑法在TK-143细胞上筛选出表达GFP的TK基因缺失的重组毒株rPRV1。将表达Cre酶的质粒载体pPOG231与rPRV1基因组DNA共转染293T细胞,在Cre酶的作用下去除GFP表达盒以及一个loxP位点,筛选得到含单个loxP位点的重组病毒株rPRV2。PCR 扩增证实所获得的重组病毒TK缺失270bp,只有一个34bp的loxP位点,并且能在RK-13细胞上稳定传代。LD50试验表明rPrV2的毒力下降。     

猪圆环病毒II型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达

为了建立一种简便的检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本实验将PCV2的ORF2基因片段整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X-33染色体上,构建了X-33(pPICZa-ORF2)重组工程菌.经甲醇诱导后,成功的表达出ORF2基因片段.经过Bradford 蛋白质总含量测定和凝胶薄层扫描结果表明,表达产物占重组工程菌培养上清总蛋白的58%,表达量可达47mg/ L.间接ELISA结果初步表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分PCV2型病毒标准阳性与阴性血清.