抗虫双价基因表达载体的构建及微束激光转化植物研究

将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体(Bacillus thuringiensis,Bt)蛋白的基因与反枝苋菜凝集素(Amaranthus retrojflexus agglutinin,ARA)基因构建成双价基因的表达载体,编码一种既能抗鳞翅目害虫,又能抗同翅目蚜虫的杀虫蛋白.把双价基因(Bt-BA)连接到原核表达载体pET28a和植物表达载体pBI121上,经过限制性酶切分析和PCR鉴定,结果表明:含有双价基因的原核和真核重组表达质粒均已构建成功.将该双价基因转入油菜,获得抗性小植株.     

抗虫杀菌融合基因表达载体的构建及微束激光转化植物研究

将苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白的基因(Bacillus thuringiesis,简称Bt)通过甘氨酸接头(Gly4Ser)3与一种人工合成的抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)基因与相融合,编码一种新的杀虫,并具有抗菌的蛋白。把融合基因(NAMP-Bt)连接到原核表达载体pET-28a和植物表达载体pBI-121上,经过限制性酶切分析和PCR鉴定,结果表明含有融合基因的原核和真核重组表达质粒均已构建成功,并将该融合基因转入烟草,已获得抗性小植株。     

丁香属植物叶片表皮形态特征与环境适应及系统学关联

通过对丁香属内2组4系1亚属的7种野生种质的叶片表皮形态特征比较,分析了它们在系(亚属)水平上的环境适应机制差异及其与系统学的关联。结果表明:广域分布的暴马丁香(拟女贞亚属)和华北紫丁香(欧丁香系)的叶片表皮的蜡质纹饰呈中心条纹状和放射状排列且较厚,表皮细胞体积较小,气孔小型化且密度高,它们比其余5个区域分布种显示出更强的适应性环境响应能力;与自然光照环境下相比较,羽叶丁香在林下遮荫光环境下的表皮细胞体积变大,叶片气孔密度减少,气孔开张度增大,而气孔开张的变化只发生在气孔的纬向宽度上,而气孔长轴相对稳定;从气孔器类型、蜡质纹饰、表皮细胞形态及垂周壁特征看,暴马丁香和华北紫丁香明显带有较为进化的特征,羽叶丁香系、巧玲花系和顶生花序系可能具有较近的亲缘关系。     

海岛棉GbTCP14基因的克隆与表达分析

以海岛棉‘新海21号’为试验材料,根据陆地棉GhTCP14基因序列,设计1对引物,通过RT-PCR技术获得海岛棉GbTCP14核苷酸序列,开放阅读框长1 221bp,编码406个氨基酸,分子式C1892H2950N572O620S16,预测分子量为44.134 6kD,等电点为6.88,氨基酸序列包含1个高度保守的TCP结构域及4个低丰度复杂区。GbTCP14蛋白氨基酸序列与其他物种TCP14氨基酸序列比对表明,海岛棉GbTCP14蛋白与其他植物中的TCP14蛋白共同具有一个高度保守的TCP结构域,序列之间的一致性较高。进化树分析表明,海岛棉GbTCP14基因与木本棉GaTCP14基因分布在同一分支上。实时荧光定量PCR表明,海岛棉GbTCP14基因在开花后第15天时表达量最高,在第5~20天时相对表达量比其他时期较高,第25天时相对表达量最低。在不同组织中花瓣和花萼中表达量较高,根和茎中表达量一般,叶组织中表达量最低。通过酵母系统转录激活分析显示,GbTCP14蛋白不具有转录活性。     

线果芥CpNSP5基因的克隆及表达分析

以该实验室前期从线果芥(Conringia planisiliqua L.)中通过mRNA差异显示技术筛选到的414bp干旱响应相关核心片段为基础,采用RACE技术对该片段进行全长克隆,序列比对分析发现,该片段与拟南芥的AtNSP5基因相似性较高,命名为CpNSP5。CpNSP5基因全长1 228bp,开放阅读框966bp,编码321个氨基酸。推测蛋白分子量为35.034 5kD,等电点为5.41。蛋白二级结构预测包含26个β-折叠,具有典型的Kelch repeat结构。系统进化分析发现,CpNSP5与白菜亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测发现,CpNSP5基因在20%PEG-6000和200mmol·L~(-1) NaCl胁迫下均受到不同程度诱导,说明CpNSP5基因可能与线果芥响应逆境胁迫有关。该研究结果为作物的抗旱育种提供了候选基因。     

拟南芥agl16突变体的创制及功能鉴定

AGL16是调控拟南芥气孔密度和ABA含量的重要负调控转录因子,在拟南芥抗旱反应过程中发挥重要的作用。为了获取拟南芥agl16突变体材料,采用棉花叶皱缩病毒(CLCrV)介导的VIGE系统筛选靶向敲除拟南芥AGL16的sgRNA,同时利用农杆菌介导的浸花法将完整编辑载体转化野生型拟南芥,创制了拟南芥agl16突变体并进行抗旱性鉴定。结果表明：(1)利用CLCrV介导的VIGE系统筛选获得2个能靶向敲除AGL16基因的sgRNA,同时构建AtU6 26∷AtAGL16 sgRNA1 35S∷Cas9 Ter p1300编辑载体转化野生型拟南芥Col 0,筛选获得靶位点缺失4 bp的agl16纯合突变体(AGL16: 4)。(2)抗旱表型性鉴定结果显示,干旱处理18 d后,大部分野生型植株干枯死亡,而突变体植株受胁迫的表型相对较轻;复水后,野生型和突变体植株的存活率分别为34.5%(10/29)和75%(27/36)。(3)与野生型相比,干旱胁迫下AGL16: 4纯合突变体植株叶片单位面积气孔数量减少、离体叶片失水率显著降低,但二者的单株种子量并没有发生明显的改变。研究认为,AGL16: 4纯合突变体的抗旱性较野生型明显增强,且种子量与野生型基本一致,表明AGL16基因可作为作物抗旱育种理想的候选靶基因;所获得的agl16突变体为后期从农作物中克隆的AGL16同源基因进行功能回补验证提供了有利的转基因受体材料。     

广东高州7个普通野生稻居群遗传结构的SSR分析

利用32对SSR引物对来自全部7个自然居群的217份广东高州普通野生稻（简称＂高野＂）材料进行遗传结构、多样性和遗传聚类分析。结果表明,高野各居群因遗传结构存在差异而相对独立,但各居群之间由于存在基因渗透又具有一定的相似性。高野总体多样性指数（Ht）为0.65,居群内的多样性（HS=0.431）略大于居群间的多样性（DS=0.392）,二者差异并不显著。居群间的遗传分化系数（GST）为0.611,说明高野群体的遗传差异是由居群内和居群间的遗传分化共同作用的结果。其中A、B、E居群间,D、F、G居群间遗传相似性较高,C居群与其它居群之间存在较大差异。根据7个居群的遗传结构,结合其地理分布状况,认为遗传多样性最大的B和E居群以及遗传分化最小的C居群应作为重点对象进行保护。     

海岛棉GbHCT13基因的功能验证

该研究利用海岛棉‘新海21’和陆地棉ND203以及模式植物拟南芥,通过转基因及荧光定量检测等方法探究海岛棉GbHCT13基因(GenBank 登录号MW048849)在纤维发育中的功能。结果显示：(1)成功构建重组载体pCAMBIA3301 GbHCT13,经农杆菌介导法转化、除草剂抗性基因筛选、荧光定量检测方法鉴定获得转GbHCT13基因拟南芥T₃代植株4株;qRT PCR检测表明,转基因植株中GbHCT13基因表达量较野生型极显著增加。(2)转基因拟南芥过表达GbHCT13基因使植株同一时期的生长较野生型旺盛,株形、叶片数、抽薹数和茎秆表皮毛数量均与野生型存在差异;组织化学分析发现,转GbHCT13基因的拟南芥较野生型茎秆初生木质部生长活跃,导管增粗,次生木质部导管细胞壁横截面积变大,但髓质细胞无明显变化;过表达GbHCT13使拟南芥中木质素合成途径基因发生不同程度改变,其中CAD、CCoAOMT、PAL和4CL与GbHCT13基因的表达呈正相关。(3)经大田筛选、分子鉴定,成功获得转GbHCT13基因棉花植株3株;转GbHCT13基因棉花的棉纤维伸长率增加,纤维强度增大;沉默GbHCT13基因使棉花植株木质素含量降低,茎秆表皮毛数量减少,木质部导管细胞数量减少,导管细胞壁中木质素沉积量降低,而棉株并未发生株高上的明显矮化现象,且木质素合成通路中的CAD、CCoAOMT、CCR、PAL 4个基因的表达均呈降低趋势,说明抑制GbHCT13使得棉花生长代谢受阻,影响纤维发育起始。研究表明,GbHCT13基因能影响棉花植株中木质素合成从而调控纤维的生长发育,其功能与GbHCT13基因在模式植物拟南芥中的基本一致。     

海岛棉GbGSTU7的克隆及其对枯萎病菌侵染的应答

该研究基于前期转录组测序数据分析,采用RT-PCR方法从海岛棉06-146中克隆得到参与海岛棉抗枯萎病调控的候选基因谷胱甘肽转移酶基因(GbGSTU7),对其序列进行生物信息学分析,并对GbGSTU7基因在病菌侵染下不同组织的表达特性进行分析,以探讨GbGSTU7基因与棉花抗枯萎病的关系。结果显示:(1)GbGSTU7基因CDS全长711 bp,编码236个氨基酸,属于GST家族tau类,二级结构由5个β折叠和9个α螺旋构成,三级结构呈球状。(2)枯萎病菌侵染后,GbGSTU7基因表达量在抗枯萎病品种06-146的根中呈下降趋势,48 h达到最低,茎和叶中呈先升高再降低的趋势,在茎中12 h达到最高,在叶中24 h达到最高;在感枯萎病品种‘新海14’的根中呈先下降再上升趋势,且在8 h达到最低,在茎和叶中的趋势无明显规律,但在茎中8 h达到最高,在叶中4 h达到最高;且两个材料中均表现为GbGSTU7基因在根中的表达量最低时,茎的表达量升到最高。研究表明,GbGSTU7基因在海岛棉抗、感病材料的各组织中均可响应枯萎病菌的诱导表达,且均具有明显的组织特异性;推测GbGSTU7基因可能与棉花抗枯萎病有着密切的关系,可能在棉花抵御病菌侵染的过程中发挥重要的调控作用。     

陆地棉干旱胁迫相关基因GhPR-10的克隆及表达分析

病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins,PR)的产生与积累是植物体应对生物或非生物胁迫的主要特征之一,而病程相关蛋白10(PR-10)是这类蛋白家族中的重要成员。该研究在前期蛋白质组学分析的基础上,采用同源克隆法和RACE技术相结合,设计了一对引物,克隆了陆地棉"KK1543"干旱胁迫下差异表达的Gh PR-10。Gh PR-10基因具有一个432 bp的开放阅读框,编码144个氨基酸,预测分子量约为15.6 k D,等电点为4.90。氨基酸序列比对和同源性分析显示Gh PR-10蛋白与其他植物中的PR-10蛋白有较高的一致性,说明该基因在进化过程中是相当保守的。系统进化树分析显示,陆地棉Gh PR-10与海岛棉、雷蒙德氏棉中蛋白的亲缘关系最近。为了研究不同胁迫条件和不同组织器官该基因的表达情况,采用荧光定量PCR技术,研究表明在15%PEG胁迫下,Gh PR-10在根中同时期的表达量大部分都比在茎和叶同时期的表达量要高;Gh PR-10的表达量在3种胁迫下变化趋势整体相似,且都呈现上调表达,干旱和盐胁迫下该基因的表达量在24 h达到最高,4℃低温胁迫下该基因在12 h达到最高。上述实验表明,Gh PR-10基因可能参与棉花防御逆境胁迫机制,为进一步研究Gh PR-10基因功能奠定了一定的基础。