三角帆蚌Nacrein基因克隆、蛋白提纯及其对珍珠晶体成型的影响

为研究三角帆蚌Nacrein蛋白对珍珠晶体成型的影响,通过巢式及3′-RACE PCR对三角帆蚌基质蛋白Nacrein基因3′端序列进行克隆,得到850bp碱基片段,分析表明其与合浦珠母贝同源基因序列相似度为56%,与马氏珠母贝相似度为50%。试验通过水提法初步分离出珍珠质水溶性基质蛋白,并采用快速蛋白液相色谱(fast protein liquid chromatography,FPLC)分离出分子量约为60kD的Nacrein蛋白。此外,采用配对试验设计,对试验组外套膜组织培养样品加入Nacrein蛋白,研究Nacrein蛋白对晶体成型的影响,结果显示,加入Nacrein蛋白的试验组结晶成棱形状;而未加Nacrein蛋白的对照组结晶成雪花状,而且在晶体形成的时间上,试验组也较之对照组要早。研究表明,Nacrein蛋白能加速外套膜组织分泌的钙质形成棱状结晶,从而对晶体成型产生影响。本研究为进一步研究基质蛋白对生物矿化的作用提供试验依据,对珍珠培育生产有一定指导意义。     

牙鲆cbx2基因的分子特征与组织表达

为鉴定牙鲆(Paralichthys olivaceus)色素框同源蛋白(Chromobox homolog,CBX)基因cbx2及探讨其在牙鲆性腺中的表达,通过PCR克隆和测序获得了cbx2 cDNA序列;利用多种生物信息学方法在线分析了牙鲆CBX2蛋白质的理化性质与空间结构,并比较了脊椎动物中cbx2的基因结构、氨基酸同源性、系统进化;运用RT-PCR技术分析了cbx2基因在牙鲆成体不同组织的表达情况。结果表明获得的牙鲆cbx2 cDNA序列包含1 584 bp的开放阅读框,编码527个氨基酸,其蛋白质分子量和等电点分别为56 578.98和10.03,是一种偏碱性的亲水性蛋白,该蛋白无信号肽,无跨膜区域,且编码该蛋白的氨基酸中以丝氨酸(Sr)的含量为最高;空间结构分析发现,牙鲆CBX2蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主,其二级结构中含有1个染色质结构域和4个低复杂结构域,该染色质结构域常结合甲基化氨基酸残基。基因结构、氨基酸同源性和系统进化分析表明cbx2基因在脊椎动物进化中较为保守,牙鲆cbx2与尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、青鳉(Oryzias latipes)的基因结构更为相似,其氨基酸同源性与杜氏鰤(Seriola dumerili)最高,为89%。RT-PCR结果显示牙鲆cbx2基因在精巢的表达量最高,卵巢次之,而在其他组织中仅有较低的表达。这些结果提示了cbx2基因在牙鲆的性腺发育中可能具有重要作用。     

中华鲟铁蛋白基因cDNA全长克隆与组织表达分析

根据铁蛋白基因的保守序列,搜索GenBank数据库中华鲟的EST数据库得到一条同源序列.通过RT-PCR的方法对该序列进行扩增,修改其测序错误,获得中华鲟铁蛋白亚基cDNA全长,经过注释提交GenBank数据库,获取序列登录号EU348782.该cDNA长度为896bp,包含531bp的完整编码区,推测编码的蛋白质为176aa,分子量为20339.9Mr,理论等电点为5.66.它和大两洋鲑鱼铁蛋白序列同源性最高,达到82.9%.该基闪在中华鲟肝脏、胰脏、肌肉、脑、心脏、鳃和胃粘膜等多种组织表达,在胰脏和心脏中表达量较高,在肌肉组织中表达较低.根据同源模建的方法得到该蛋白质三维结构,其包括5个α螺旋和10个转角结构,和人、蛙和细菌的铁蛋白均能很好的叠合,表现了很高的相似性,表明该蛋白结构和功能在基因进化中的高度保守性.     

细小病毒H—1对人肝癌移植瘤的抑制及其组织学与组织化学的研究

本文用人肝癌裸小鼠ＱＧＹ－９２０４移植模型为材料,进行了细小病毒Ｈ－１抑瘤的组织学、组织化学及分子生物学研究所。     

牙鲆甲状腺激素受体TRαA的原核表达和多克隆抗体的制备及应用

为研究牙鲆甲状腺激素受体TRαA在牙鲆变态发育过程中的调控作用,将TRαA基因克隆插入融合表达栽体pET30a,并在大肠杆菌Escherichia coli DE3(BL21)中进行诱导表达.表达菌株经1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导4 h后,重组蛋白TRaA表达并形成包涵体.SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定表达产物.包涵体经变性后在His-Bind树脂进行亲和层析纯化,柱上复性法对重组蛋白复性,获得纯度较高的目的蛋白,蛋白复性的效果良好.用纯化后的目的蛋白免疫新西兰家兔制备多克隆抗体.Dot blotting检测抗体效价达1:200 000,检测证明抗体特异性良好.此外,通过染色质免疫沉淀技术鉴定了在活体细胞中多克隆抗体与TRαA的特异性结合.表明了甲状腺激素通过其受体在体内参与碱性磷酸酶(ALP)基因的转录调控.     

三角帆蚌alpha-2巨球蛋白活性测定及不同组织的表达

alpha-2巨球蛋白(alpha-2 Macroglobulin,α2M)是一种蛋白酶结合蛋白,是重要的天然免疫因子。利用α2M的作用原理,用三角帆蚌血浆保护胰蛋白酶,后用大豆蛋白酶抑制剂抑制未被保护的胰蛋白酶。利用Na-benzoyl-DL-arg-nine-p-nitroanilide(BAPNA)作为酶底物检测被保护的蛋白酶活性的方法,首次证明了三角帆蚌体内α2M的存在。在此基础上,克隆了α2M基因保守区受体结合区片段,进一步证明了α2M在三角帆蚌体内的存在。同时,还进行了α2M不同组织的表达检测,结果显示,α2M基因在血细胞中有表达,而在外套膜、闭壳肌、肠和性腺中没有表达。     

牙鲆弹性蛋白酶cDNA全长和蛋白质结构分析

为研究牙鲆丝氨酸蛋白酶家族的功能和及其家族的分子进化规律,从本实验室已构建的牙鲆肝胰脏cDNA文库进行了部分测序,从而筛选出一个弹性蛋白酶新成员：弹性蛋白酶5。在此基础上,结合Genbank数据库中已经提交的胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶,对三者蛋白质进行了序列分析和三维结构的比较。牙鲆弹性蛋白酶cDNA包含一个完整的读码框（提交Genbank的登录号为EU873084）。其编码区平均GC含量为54％,推测编码的蛋白质包含296个氨基酸,分子量为29．04KD,等电点为6．14。蛋白序列比较表明它和牙鲆弹性蛋白酶3相似性最高。通过同源建模得到弹性蛋白酶5的三维结构和牛胰凝乳蛋白酶结构相似,包含了2个α螺旋、β个8折叠和13个转角结构。牙鲆弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶中底物结合区的3个关键氨基酸有明显的区别,这些氨基酸的变化改变了底物结合位点开口的大小,胰凝乳蛋白酶2的三个关键氨基酸和牛胰凝乳蛋白酶相同,该区域能接受结构较大的芳香族氨基酸;胰蛋白酶3能更好的结合阳性氨基酸Lys或Arg;而弹性蛋白酶开口很小,只能结合小的残基。上述结果证明了牙鲆丝氨酸蛋白酶家族中的弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶底物结合位点的结构差异决定了其对底物选择的特异性。     

MicroRNA与动物发育

MicroRNA(miRNA)是一类约22nt大小的内源性非编码RNA,它们通过剪切靶基因的转录产物或者抑制转录产物的翻译从而起到转录后调控靶基因表达的作用。在动物体内,通过基因敲除等方法所进行的大量研究表明了miRNA参与了胚胎早期发育、脑及神经发育、心脏发育、肌肉及骨骼发育等动物发育的各个方面。miRNA是动物发生发育过程中重要的调控因子。主要介绍了近年来miRNA在动物生长发育过程中的研究进展。