大肠杆菌ptsHIcrr操纵子的快速敲除及敲除菌生长性能测定

敲除大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统(简称PTS系统)ptsHIcrr操纵子,考察敲除菌株生长特性并将其与ptsG敲除菌进行比较。利用I-SceⅠ特异性切割和Red同源重组方法成功构建了大肠杆菌DH5α△ptsHIcrr敲除菌。在LB培养基中,DH5α△ptsHIcrr的生长行为与DH5α和DH5α△ptsG明显不同,其最高菌密度是DH5α和DH5α△ptsG的近2倍,而DH5α△ptsG生长行为与DH5α无明显差异。但在含1%葡萄糖的LB中,DH5α△ptsHIcrr和DH5α△ptsG均表现出生长优势,最高菌密度依次是DH5α的2.8和2倍;培养液中最终乙酸含量分别是DH5α的12.2%、47%。在M9修饰培养基中,DH5α△ptsHIcrr比生长速率(1/h)和比葡萄糖消耗速率[g/(g.h)]明显低于DH5α,并略低于DH5α△ptsG。结果说明,ptsHIcrr操纵子敲除菌改变了葡萄糖的代谢速率,并呈现与ptsG基因敲除菌不同的代谢特点。     

胸腺肤α1-Spl DnaX内含肤融合蛋白的切割动力学研究

目的:研究胸腺肤α1(Tal)与Spl DnaX内含肤融合蛋白AS的体外切割动力学.方法:构建Tαl和SplDnaX内含肤的融合表达载体pET-AS,转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导获得可溶性表达的融合蛋白AS,用镍亲和层析纯化该蛋白;综合评价温度、β-巯基乙醇(β-ME)浓度和诱导切割时间对Spl DnaX内含肤介导融合蛋白AS自切割释放Tα1的影响.结果:在大肠杆菌中诱导表达了融合蛋白AS,经镍柱纯化获得该蛋白;随着温度升高和β-ME浓度增加,诱导切割时间延长,Spl DnaX内含肤介导的切割率逐渐增大;最终采用300mmol/L β-ME切割24 h,融合蛋白的硫解切割率大于90%.结论:通过对Spl DnaX内含肤的诱导切割条件进行摸索,确定了最适宜的切割条件,为利用该方法制备Tαl和其他小分子多肤提供了技术基础.     

工程菌E.coli MM2的固定化细胞制备

固定化细胞技术是七十年代兴起的一门应用技术。固定化细胞具有细胞密度高、易进行连续生产且稀释率高、不易被污染、产物易分离、可降低设备规模等优点,已成为生物合成、生物转化的有效工具,得到广泛应用。近十年来,人们把固定化细胞技术应用到工程菌的培养中取得了一些有价值的结果。用工程菌制得的固定化细胞裂解青霉素生产6-APA,已达工业化生产水平。据文献报道,工程菌固定化后可大大提高重组质粒的稳定性,并且外源基因能稳定地表达。本所马清钧研究员等构建的工程菌     

干扰素与转铁蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达及鉴定

利用重叠 PCR 技术将干扰素 (interferon , IFN) 基因与转铁蛋白 N 端半分子 (transferrin N-terminal half-molecule , TFN) 基因在体外融合,融合基因和单独的 TFN 基因分别克隆至真核表达载体 pPIC9 中,转化毕赤酵母 GS115 ,得到的转化子经诱导表达后在发酵上清中均获得了表达 . 经 SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换层析、 Phenyl Sepharose Fast Flow 疏水层析纯化,获得了纯度大于 93 ％的重组融合蛋白 IFN-TFN 和纯度大于 95 ％的重组 TFN 样品 . 生物活性实验证明融合蛋白 IFN-TFN 具有抗病毒活性 . 铁饱和实验证明融合蛋白 IFN-TFN 和单独的 TFN 具有相同的铁结合能力 . 因而 TFN 可望作为 IFN 的天然运输载体 .     

转铁蛋白/转铁蛋白受体介导的药物运输

转铁蛋白 转铁蛋白受体介导的铁吸收过程是哺乳动物吸收铁的主要途径。近几十年的研究 ,对此过程有了充分了解。作为靶向配体 ,转铁蛋白可以介导多种金属的运输。最新研究表明转铁蛋白可以与抗癌药物、蛋白质、基因等形成复合物 ,靶向肿瘤、血脑屏障、快速分裂等大量表达转铁蛋白受体的组织。转铁蛋白偶联的药物具有靶向性强、毒副小的优点。综述了转铁蛋白 转铁蛋白受体介导的药物运输的最新研究进展。     

Unigene公司的重组降钙素

经过10年的临床前和临床研究,Unigene公司的重组降钙素近期将向FDA提出申请。该药品拟以与普通药品相似的审批程序审批,因此公司不必证明该药品能缓解骨质疏松症状。普通药品公司仅需向FDA证明他们的药品     

微囊化不可繁殖型尿酸氧化酶工程菌的制备

目的：制备微囊化不可繁殖型尿酸氧化酶工程菌,以期研制一种降低血尿酸的口服药物,用于治疗高尿酸血症及痛风。方法：用甲醛灭活尿酸氧化酶工程菌,使其不可繁殖并保持酶活性;以壳聚糖和海藻酸钠为囊材,采用气流喷雾法制备微囊;用试剂盒体外评价微囊降解尿酸的效果。结果：经甲醛灭活后,工程菌繁殖活性丧失,其降解尿酸的能力降低85%;制备的微囊粒径呈正态分布于20～220μm,包封率达到99%以上;体外试验表明其具有降尿酸活性。结论：获得了具有降解尿酸活性的微囊化不可繁殖型工程菌。     

大肠杆菌Nα-乙酰转移酶RimLE的表达、纯化及活性测定

目的:在体外鉴定大肠杆菌Nα-乙酰转移酶RimL(RimLE)的功能。RimL可以通过将原核生物的核糖体蛋白L12的N端氨基乙酰化,使其转化成L7。方法:通过PCR从大肠杆菌基因组中钓取RimLE和L12/L7E的基因,将其插入pET系统,转化大肠杆菌BL21(DE3),培养后提取、纯化得到RimLE和L12E。结果:RimLE在体外可将L12E的N端氨基乙酰化,最大反应速率为25.63/min。结论:为研究原核生物中Nα-乙酰化的分子机制及其功能奠定了基础。     

在大肠杆菌内引入甲羟戊酸途径高效合成抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11-二烯

以青蒿素为基础的联合药物疗法 (ACTs) 被认为是目前治疗恶性疟疾的最有效方法。然而青蒿素供应不足且价格昂贵,限制了ACTs的广泛使用。采用基因工程手段构建异源类异戊二烯生物合成途径,利用大肠杆菌发酵能高效合成抗疟药青蒿素前体——紫穗槐-4,11-二烯。首先在大肠杆菌Escherichia coli DHGT7中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因,利用大肠杆菌内源的法尼基焦磷酸,成功获得了紫穗槐-4,11-二烯。为提高前体供给,引入粪肠球菌的甲羟戊酸途径,紫穗槐-4,11-二烯的产量提高了13     

甲状旁腺激素和转铁蛋白N端半分子融合蛋白在毕赤酵母中的表达

用重叠PCR技术将PTH（parathyroid hormone, 甲状旁腺激素）基因与TFN（transferrin N_terminal half_molecule, 转铁蛋白N端半分子）基因在体外融合,融合基因克隆至真核表达载体pPIC9中,转化毕赤酵母GS115。转化子经甲醇诱导后,融合蛋白得到了表达并分泌到发酵上清液中。经 SP Sepharose F F阳离子交换层析、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析纯化获得了纯度大于95％的PTH_TFN样品。Western blot分析及腺苷酸环化酶实验证明融合蛋白中的PTH具有与抗PTH抗体结合能力及刺激腺苷酸环化酶的活性,铁饱和实验证明融合蛋白中的TFN和单独的TFN具有相同铁结合能力。因而TFN可望作为PTH的天然运输载体。