胸腺肽β4研究进展

β胸腺肽是一个多肽家族,由高度保守的极性氨基酸组成,相对分子质量约5000.研究表明,在绝大多数哺乳动物组织中,胸腺肽β4都是该家族丰度最高的成员。1991年发现胸腺肽β4是人血小板中主要的肌动蛋白隐蔽肽,随后发现它在创伤愈合和血管生成、角膜修复、抑制炎症及肿瘤转移等方面具有重要作用。我们简要综述胸腺肽β4的上述作用及临床应用的研究进展。     

蛋白质剪接研究进展

蛋白质剪接是一个翻译后自催化加工过程,它不需要酶或其他辅助因子的参与。在这个过程中,前体蛋白的Intein(内含肽)被切离,其两侧的Extein(外显肽)连接在一起。Intein按结构可分为经典Intein和微型Intein,其中的经典Intein包括Hint结构域和中间的归巢内切酶结构域(该结构域在微型内含肽中不存在)。蛋白质剪接及其他具有Hint结构域的蛋白加工过程的起始步骤是N-S/O酰基重排反应,该反应是由Hint结构域催化的;Intein的剪接还分为顺式剪接和反式剪接,通过对Intein进行改造,可以阻断剪接过程,但不影响N端肽键或C端肽键的断裂;通过筛选突变体,可以获得温度敏感型、pH敏感型或小分子诱导型的内含肽。这些研究促进了Intein在多肽制备及其它方面的应用。     

霍乱毒素B亚单位与谷氨酸脱羧酶抗原表位肽融合蛋白的表达及鉴定

目的:在大肠杆菌中表达霍乱毒素B单位(CTB)与谷氨酸脱羧酶(GAD)抗原表位肽段(531～545)的融合蛋白。方法:通过PCR技术将CTB基因与GAD基因融合在一起,插入pET22b载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经诱导获得融合基因的表达;对表达产物进行包涵体复性后,纯化得到融合蛋白分子;对该融合蛋白分子进行了Western印迹和GM1-ELISA分析。结果:表达的融合蛋白的相对分子质量约为14000,Western印迹表明该融合蛋白具有霍乱毒素抗原性;GM1-ELISA实验表明该融合蛋白能够特异性地结合神经节苷酯GM1,表明该蛋白具有与CTB相似的五聚体结构。结论:融合蛋白CTB-GAD的成功表达,为后续动物实验提供了充足的抗原。     

化学交联在蛋白质结构研究中的应用

在交联剂分子两端各有一个相同或不同的活性基团,它们能与蛋白质侧链上的氨基、巯基、羟基等形成共价交联.利用交联反应,可以测定寡聚蛋白质的亚基数量、研究蛋白质的高级结构、测量氨基酸残基间的距离及研究蛋白质间的相互作用.     

胸腺肤α1-Spl DnaX内含肤融合蛋白的切割动力学研究

目的:研究胸腺肤α1(Tal)与Spl DnaX内含肤融合蛋白AS的体外切割动力学.方法:构建Tαl和SplDnaX内含肤的融合表达载体pET-AS,转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导获得可溶性表达的融合蛋白AS,用镍亲和层析纯化该蛋白;综合评价温度、β-巯基乙醇(β-ME)浓度和诱导切割时间对Spl DnaX内含肤介导融合蛋白AS自切割释放Tα1的影响.结果:在大肠杆菌中诱导表达了融合蛋白AS,经镍柱纯化获得该蛋白;随着温度升高和β-ME浓度增加,诱导切割时间延长,Spl DnaX内含肤介导的切割率逐渐增大;最终采用300mmol/L β-ME切割24 h,融合蛋白的硫解切割率大于90%.结论:通过对Spl DnaX内含肤的诱导切割条件进行摸索,确定了最适宜的切割条件,为利用该方法制备Tαl和其他小分子多肤提供了技术基础.     

工程菌E.coli MM2的固定化细胞制备

固定化细胞技术是七十年代兴起的一门应用技术。固定化细胞具有细胞密度高、易进行连续生产且稀释率高、不易被污染、产物易分离、可降低设备规模等优点,已成为生物合成、生物转化的有效工具,得到广泛应用。近十年来,人们把固定化细胞技术应用到工程菌的培养中取得了一些有价值的结果。用工程菌制得的固定化细胞裂解青霉素生产6-APA,已达工业化生产水平。据文献报道,工程菌固定化后可大大提高重组质粒的稳定性,并且外源基因能稳定地表达。本所马清钧研究员等构建的工程菌     

MM工程菌的大规模发酵培养工艺研究

首先在50L发酵罐上研究了MM工程菌的发酵培养工艺。确定了接种量4％,搅拌转速300～500r／min,pH7,2和糖补加速率0．066 g．(L·mjn)^-1等参数,活菌数可达每毫升211亿。以氧传递系数为放大准则可成功地将该工艺在200L倒产发酵罐上再现,说明该工艺具有可放大性。     

霍乱毒素B亚单位工程菌MM2的表达与lac启动子的关系

研究了不同碳源(葡萄糖、乳酸和乙酸)以及IPTG诱导对工程菌MM2表达霍乱毒素B亚单位(CTB)的影响,ctb基因位于lac启动子的下游。在YC培养基中分别加入0.048mol/L的葡萄糖、0.102mol/L的乳酸和0.167mol/L的乙酸,它们在完全氧化后可产生相同的能量。结果表明,加入葡萄糖会大幅度降低ctb基因的表达水平,其原因和培养过程中pH值下降有关;加入乳酸可提高ctb基因表达水平1.15倍,且不抑制菌体生长;加入乙酸可提高ctb基因的表达水平0.9倍,但对菌体生长有抑制作用。不同时间及不同浓度的IPTG诱导未能提高ctb基因的表达水平,说明lac启动子对ctb基因的表达没有影响或影响很小。     

重组巴曲酶在毕赤酵母中的高效表达

以毕赤酵母为表达系统,建立生产重组巴曲酶的技术工艺路线。通过递归式PCR的方法,人工合成了巴曲酶基因,将其插入pPIC9表达质粒中,转化至毕赤酵母GS115(his4),筛选出的表达株经甲醇诱导,表达了重组巴曲酶,并得以纯化。从每升发酵液中可纯化得到10mg重组巴曲酶,其比活为238NIHunits/mg,分子量为30.55kD。重组巴曲酶在体外可使纤维蛋白凝固,在体内缩短小鼠出血时间。为开发重组的蛇毒类凝血酶止血剂打下了基础。     

甲醇营养型酵母高密度培养过程中甲醇和乙醇的GC快速检测

采用气相色谱法（GC）快速检测甲醇营养型酵母发酵液中的甲醇、乙醇含量,具有样品处理简便,测定时间较短,结果重视性好的特点。在1－10mg/mL范围内具有很好的线性关系。在毕赤酵母高密度表达发酵过程中应用此法对甲醇和乙醇进行实时监空,细胞终密度超过300g/L（干重）。本方法为甲醇营养型酵母工程菌的发酵中试工艺研究提供了重要 的发酵生化参数。